该协议允许研究穆勒胶质细胞在用特定因子（如microRNA）处理后转化为视网膜祖细胞的潜力和能力。该技术的优点是microRNA候选物可以在体内应用之前测试其效率和结果。帮助演示该程序的是来自Stefanie Wohl实验室的博士生Seoyoung Kang。
首先，将取出的眼球短暂浸入装有乙醇的管中，以避免细菌从动物身上携带。然后，在10厘米的培养皿中短暂清洗眼球，然后将其放入冰上的24孔板中。取出眼球并清洁后，将一只眼睛放入带有光源的解剖显微镜下的解剖盘中。
现在，用Dumont 5细镊子抓住巩膜周围的视神经和周围的结缔组织，并将其小心地按压在解剖盘上，从而固定一个眼球。接下来，使用 30 号针在角膜中心开一个洞，以便更容易地进入静脉剪刀。然后，使用静脉剪刀解剖睫状体周围的角膜，并用Dumont 5细钳小心地去除角膜，晶状体，虹膜和玻璃体。
然后用静脉剪刀解剖巩膜，直到到达视神经，并使用Dumont 5细钳小心地提取视网膜。现在使用第二个Dumont 5细钳子推动视网膜并完全去除玻璃体。将视网膜切开无菌移液器尖端约2.5厘米以扩大直径。
现在使用此尖端，在不损坏组织的情况下拾取整个视网膜，并将视网膜转移到带有冷HBSS的新无菌培养皿中并摇动培养皿。接下来，使用新的无菌移液管，小心地推动视网膜以洗掉视网膜色素上皮细胞。立即将分离的视网膜放入装有一毫升HBSS的24孔板的新清洁孔中，同时在解剖过程中将24孔板保持在冰上。
按照手稿中的说明制备木瓜蛋白酶 DNase I 解离混合物。现在使用扩大的吸头转移移液器，拾取视网膜。等到视网膜沉淀在尖端底部，然后将没有过多HBSS的视网膜释放到含有木瓜蛋白酶DNase I混合物的管中。
接下来，将试管放在培养箱中的章动器上，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 10 分钟。接下来，用一毫升移液器小心地上下移液来解离细胞。细胞解离后，从木瓜蛋白酶解离试剂盒中加入 275 μL 卵木蛋白酶抑制剂以中和木瓜蛋白酶并通过上下移液轻轻混合。
将试管放入离心机中，以 300 的相对离心力在 4 摄氏度下旋转 8 分钟。将表皮生长因子添加到在37摄氏度预热的生长培养基的计算体积中。小心地从离心机中取出试管。
在不接触管底部的沉淀的情况下，小心地完全除去上清液。现在用500微升补充的表皮生长因子生长培养基重悬细胞沉淀。然后，将细胞悬液转移到标记的12孔板的一个孔中。
用另外500微升补充的表皮生长因子生长培养基冲洗管，并将其添加到孔中。小心摇动孔板，然后将板放入含有二氧化碳的37摄氏度的培养箱中。首先检查90%至100%的细胞汇合度。
接下来，取出培养基并加入一毫升冷HBSS清洗井。轻轻摇动板并去除HBSS，不留下任何痕迹。之后，加入500微升含有预热胰蛋白酶的溶液，将细胞从孔中分离出来。
轻轻摇晃，在 37 摄氏度的培养箱中孵育两分钟。将板从培养箱移动到生物安全柜后，在倾斜的同时吸出含有胰蛋白酶的溶液。小心地缓慢地将其分散在孔上几次，直到细胞完全分离。
接下来，将该细胞悬液转移到无菌的1.5毫升管中，并将管放入离心机中。在 4 摄氏度下以 300 倍克旋转 8 分钟，然后将试管带回生物安全柜。在不接触沉淀的情况下除去上清液。
现在，通过加入600微升预热的生长培养基并上下移液约30至40次，小心地重悬细胞沉淀。最后，将100微升获得的细胞悬液接种在24孔板的六个包被盖玻片的中心。将板放在培养箱上，让细胞沉淀，以便使用micro RNA模拟物进行后续转染。
该图显示了转染五天后存在一些Ascl1-Tomato阳性细胞的对照条件。然而，在miR-25处理后，发现了更多的Ascl1-番茄阳性细胞。定量显示，与对照组相比，miR-25处理孔中Ascl1-Tomato阳性细胞的数量增加了四倍。
最重要的是，在riR-25处理孔中发现的绝大多数Ascl1-Tomato阳性细胞都采用了神经元形态。这种神经元形态的特征包括细胞体大小减小，精细过程的发展和微小网络的形成。定量显示，约70%的Ascl1-番茄阳性细胞具有神经元特征。
免疫荧光标记显示，具有神经元形态的Ascl1-番茄阳性细胞表达神经标志物OTX2和MAP2，确认神经元身份。这些细胞的定量显示，在miR-25过表达后，每个场存在约40个Ascl1-Tomato阳性神经元，而对照组中每个场存在5个神经元细胞。鉴定的神经元细胞约占miR-25处理样品中Ascl1-Tomato阳性细胞群总量的70%。
此外，OTX2和MAP2共表达神经元绝对数量的定量表明，在miR-25处理后，每个场发现约60个神经元，而对照组每个场发现10个神经元。必须使用清洁和无菌的工具在清洁和消毒的环境中工作，并通过避免任何苛刻的处理来仔细工作。下游应用可以是例如蛋白质定量、DNA 或 RNA 分析或电生理研究。
这项技术帮助我们探索了属于再生医学领域的核重编程的初始问题。为了探索新问题，可以测试各种各样的因素和条件。
