Этот протокол позволяет изучить потенциал и способность глии Мюллера превращаться в клетки-предшественники сетчатки после лечения специфическими факторами, такими как микроРНК. Преимущество этого метода заключается в том, что кандидаты на микроРНК могут быть проверены на их эффективность и результат перед их использованием в приложениях in vivo. Помочь в демонстрации процедуры будет Seoyoung Kang, аспирант из лаборатории Стефани Воль.
Во-первых, ненадолго окуните удаленное глазное яблоко в трубку с этанолом, чтобы избежать переноса бактерий от животного. Затем ненадолго промойте глазное яблоко в 10-сантиметровой чашке Петри, прежде чем поместить его в 24-луночную тарелку на льду. После того, как глазные яблоки удалены и очищены, поместите один глаз в тарелку для рассечения, помещенную под рассекающий микроскоп с источником света.
Теперь зафиксируйте одно глазное яблоко, захватив зрительный нерв и окружающую соединительную ткань вокруг склеры с помощью 5 тонких щипцов Дюмона и осторожно прижмите его к тарелке для рассечения. Затем сделайте отверстие в центре роговицы, используя иглу 30 калибра, чтобы обеспечить более легкий доступ для венозных ножниц. Затем рассекните роговицу вокруг цилиарного тела с помощью венозных ножниц и аккуратно удалите роговицу, хрусталик, радужную оболочку и стекловидное тело с помощью 5 тонких щипцов Дюмона.
Позже рассекните склеру венозными ножницами до тех пор, пока зрительный нерв не будет достигнут, и осторожно извлеките сетчатку с помощью тонких щипцов Дюмона 5. Теперь используйте второй Dumont 5 тонких щипцов, чтобы надавить на сетчатку и полностью удалить стекловидное тело. Перенос сетчатки разрезается примерно на 2,5 сантиметра кончика стерильной переносной пипетки для увеличения диаметра.
Теперь, используя этот наконечник, подберите целые сетчатки, не повреждая ткани, и перенесите сетчатку в новую стерильную чашку Петри с холодным HBSS и качайте чашку. Затем, используя новую стерильную переносную пипетку, осторожно протолкните сетчатку, чтобы смыть пигментные эпителиальные клетки сетчатки. Немедленно поместите изолированную сетчатку в новый чистый колодец из 24 луночной пластины, заполненной одним миллилитром HBSS, сохраняя при этом 24-луночную пластину на льду во время рассечения.
Готовят смесь диссоциации Papain DNase I, как описано в рукописи. Теперь с увеличенным наконечником переносной пипетки поднимите сетчатку. Подождите, пока сетчатка осядет в нижней части кончика и выпустите сетчатку без чрезмерного HBSS в трубку, содержащую смесь Папаин Днказы I.
Далее поместите трубку на нутатор в инкубаторе и инкубируйте в течение 10 минут при 37 градусах Цельсия и с 5% углекислым газом. Затем диссоциируйте клетки, тщательно пипетируя вверх и вниз одной миллилитровой пипеткой. После диссоциации клеток добавьте 275 микролитров ингибитора овомукуоидной протеазы из набора диссоциации папаина, чтобы нейтрализовать папаин и мягко перемешать, пипетируя вверх и вниз.
Поместите трубки в центрифугу и вращайтесь при четырех градусах Цельсия в течение восьми минут с относительной центробежной силой 300. Добавьте эпидермальный фактор роста к расчетному объему питательной среды, предварительно нагретой при 37 градусах Цельсия. Осторожно извлеките трубки из центрифуги.
Не касаясь гранулы в нижней части трубки, удалите супернатант осторожно и полностью. Теперь повторно суспендируют клеточную гранулу с 500 микролитрами эпидермального фактора роста, дополненного питательной средой. Затем переместите клеточную суспензию в одну лунку из меченой 12-луночной пластины.
Промыть трубку еще 500 микролитрами эпидермальной добавляемой фактором роста питательной среды и добавить ее в лунку. Осторожно покачайте плиту колодца, затем поместите пластину в инкубатор при температуре 37 градусов по Цельсию с углекислым газом. Начните с проверки на слияние клеток от 90% до 100%.
Затем удалите среду и добавьте один миллилитр холодного HBSS для мытья лунки. Аккуратно покачайте пластину и удалите HBSS без каких-либо следов. Позже добавляют 500 микролитров предварительно подогретого трипсина, содержащего раствор, чтобы отделить клетки от лунки.
Качать аккуратно и насиживать в течение двух минут в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия. После перемещения пластины из инкубатора в шкаф биобезопасности аспирируйте раствор, содержащий трипсин, при наклоне. Рассейте его осторожно и медленно по лунке несколько раз, пока клетки не отделятся полностью.
Затем переложите эту клеточную суспензию в стерильную трубку размером 1,5 миллилитра и поместите трубки в центрифугу. Вращайте в 300 раз г в течение восьми минут при четырех градусах Цельсия и верните трубки обратно в шкаф биобезопасности. Удалите супернатант, не прикасаясь к грануле.
Теперь осторожно повторно суспендируйте гранулу клетки, добавив 600 микролитров предварительно нагретой питательной среды и пипеткой вверх и вниз примерно 30-40 раз. Наконец, засевают 100 микролитров полученной клеточной суспензии в центр шести покрытых покрытием слипов пластины 24 скважины. Поместите пластину на инкубатор и дайте клеткам осесть для последующей трансфекции с использованием микро-Имитирования РНК.
На рисунке показаны контрольные условия через пять дней после трансфекции с несколькими положительными клетками Ascl1-Tomato. Однако после лечения miR-25 обнаруживается гораздо больше положительных клеток Ascl1-Tomato. Количественная оценка показала четырехкратное увеличение числа ascl1-томатных положительных клеток в обработанных miR-25 скважинах по сравнению с контрольной группой.
Самое главное, что подавляющее большинство положительных клеток Ascl1-Tomato, обнаруженных в обработанных riR-25 колодцах, приняли нейронную морфологию. Особенности этой морфологии нейронов включали уменьшение размера клеточной сомы, развитие тонких процессов и образование крошечных сетей. Количественная оценка показала, что около 70% всех положительных клеток Ascl1-Tomato имели нейронные особенности.
Иммунофлуоресцентная маркировка показывает, что положительные клетки Ascl1-Tomato с нейрональной морфологией экспрессируют нейронные маркеры OTX2 и MAP2, подтверждая нейронную идентичность. Количественная оценка этих клеток показала, что после сверхэкспрессии miR-25 присутствует около 40 положительных нейронов Ascl1-Tomato на поле по сравнению с пятью нейронными клетками на поле в контрольной группе. Идентифицированные нейрональные клетки составляют около 70% от общей популяции ascl1-Tomato положительных клеток образцов, обработанных miR-25.
Кроме того, количественная оценка абсолютного числа совместно экспрессирующих нейронов OTX2 и MAP2 показала, что после обработки miR-25 было обнаружено около 60 нейронов на поле по сравнению с 10 нейронами на поле в контрольной группе. Крайне важно работать в чистой и дезинфицированной среде с чистыми и стерильными инструментами и работать осторожно, избегая любого сурового обращения. Последующие приложения могут быть, например, количественной оценкой белка, анализом ДНК или РНК или электрофизиологическими исследованиями.
Этот метод помог нам исследовать первоначальные вопросы о ядерном перепрограммировании, которое относится к области регенеративной медицины. И существует большой спектр факторов и условий, которые можно проверить, чтобы исследовать новые вопросы.
