Ce protocole détaille toutes les procédures expérimentales, du marquage épitope des gènes codant pour le facteur de transcription à l’analyse des données informatiques, pour effectuer un profilage à l’échelle du génome des interactions de liaison facteur de transcription-ADN chez Candida albicans via CUT&RUN. Il s’agit d’une technique plus accessible, plus rapide, plus sensible et moins coûteuse, qui fournit des données de meilleure qualité que les approches traditionnelles chIP-chip et ChIP-seq. Bien que notre protocole soit développé pour les cellules de Candida albicans isolées à partir de biofilms ou de cultures planctoniques, il devrait être pratique de l’adapter à pratiquement toute bonne forme de cellules de Candida albicans.
Après avoir incubé la suspension cellulaire, transférer une aliquote de cinq microlitres dans un nouveau tube PCR. À cinq microlitres de noyaux isolés et à une aliquote de cinq microlitres de cellules intactes précédemment stockées à quatre degrés Celsius, ajoutez un microlitre de blanc calcofluor et de SYTO 13. Incuber à 30 degrés Celsius dans l’obscurité pendant 30 minutes.
Inspectez visuellement l’intégrité et la pureté des noyaux isolés à l’aide d’un microscope à fluorescence. Recherchez des noyaux isolés présentant une coloration SYTO 13 proéminente et assurez-vous qu’il n’y a pas de coloration de la paroi cellulaire par le colorant blanc calcofluor. Répétez l’inspection avec des cellules intactes comme contrôle de la coloration de la paroi cellulaire avec un colorant blanc calcofluor.
Placez les tubes sur une grille magnétique et attendez que la boue soit complètement dégagée. Jetez le surnageant à l’aide d’une pipette. Ajouter 50 microlitres du tampon d’anticorps et mélanger doucement par pipetage.
Ajouter trois microlitres de l’anticorps polyclonal anti-GFP aux tubes et incuber les tubes sur un mélangeur à noisette à 4 degrés Celsius pendant deux heures. Centrifugez brièvement les tubes à 100 fois g à température ambiante pendant cinq secondes et placez les tubes sur un rack magnétique. Une fois que la boue est claire, jetez le surnageant à l’aide d’une pipette.
Pendant que les tubes avec les perles sont toujours sur le rack magnétique, ajoutez 200 microlitres de tampon de perméabilisation des cellules glacées directement sur les perles. Jetez le surnageant à l’aide d’une pipette. Répétez deux lavages avec le tampon de perméabilisation cellulaire glacé.
Ajouter 50 microlitres de tampon de perméabilisation cellulaire glacée à chaque tube et mélanger doucement par pipetage. Ajouter 2,5 microlitres de la protéine AG-MNase à chaque échantillon et mélanger par pipetage. Placez les échantillons sur un mélangeur à noisette à 4 degrés Celsius et incubez les échantillons pendant une heure.
Centrifugez brièvement les tubes à bande à 100 fois g à température ambiante pendant cinq secondes, puis placez les tubes sur un rack magnétique. Une fois que la boue est claire, jetez le surnageant à l’aide d’une pipette. Pendant que les tubes avec les perles sont toujours sur le rack magnétique, ajoutez 200 microlitres de tampon de perméabilisation des cellules glacées directement sur les perles.
Jetez le surnageant à l’aide d’une pipette. Répétez deux lavages avec le tampon de perméabilisation cellulaire glacé. Ajouter 100 microlitres du tampon de perméabilisation des cellules glacées aux échantillons et pipeter doucement de haut en bas cinq fois.
Retirez le gel coulé de la boîte de gel et ouvrez le gel moulé selon les instructions du fabricant. Retirez doucement le gel du gel coulé et placez-le dans un plateau contenant 100 millilitres de TBE à force unique. Ajouter 10 microlitres de la tache de gel d’acide nucléique sur le plateau et faire tourbillonner doucement.
Couvrir avec du papier d’aluminium pour protéger de la lumière et incuber statiquement à température ambiante pendant 10 minutes. Rincez ensuite le gel deux fois avec 100 millilitres d’eau du robinet désionisée. Imagez le gel sous éclairage à la lumière bleue à l’aide d’un couvercle filtrant orange.
Pour chaque bibliothèque, coupez le gel légèrement au-dessus de la bande dimère d’adaptateur proéminente d’environ 125 paires de bases et en dessous de la marque d’échelle de 400 paires de bases. Perforez le fond d’un tube de 0,65 millilitre à l’aide d’une aiguille de calibre 22 et placez le tube perforé à l’intérieur d’un tube de microfuge stérile de deux millilitres. Transférer la tranche de gel dans le tube perforé à l’intérieur du tube de microfuge de deux millilitres.
Centrifuger le tube de microfuge de deux millilitres contenant le tube perforé de 0,65 millilitre et échantillonner à 10 000 fois g à température ambiante pendant deux minutes pour recueillir la boue de gel à l’intérieur du tube de microfuge de deux millilitres. Ajouter 300 microlitres de tampon d’élution de gel glacé à la boue de gel. Mélanger sur un nutateur à température ambiante pendant au moins trois heures ou toute la nuit.
Transférer toute la boue liquide et gel dans une colonne filtrante de 0,22 micromètre et centrifuger à 10 000 g à température ambiante pendant une minute. Téléchargez le code source de l’analyse CUT&RUN à partir de la page GitHub en cliquant sur le bouton vert Code, suivi de l’option Télécharger ZIP. Décompressez le dossier à un emplacement approprié sur l’ordinateur local.
Installez Conda Environment et exécutez-le une seule fois. Une fois Conda installé, créez un environnement virtuel doté de la commande appropriée. Activez l’environnement virtuel chaque fois que ce flux de travail est exécuté.
La digestion de la paroi cellulaire et l’intégrité nucléaire ont été évaluées en visualisant à la fois des cellules intactes témoins et des noyaux isolés colorés avec des taches de paroi cellulaire fluorescente et d’acide nucléique. Contrairement aux noyaux intacts isolés où la coloration de la paroi cellulaire n’est pas observée, les noyaux et les parois cellulaires sont marqués par fluorescence dans les cellules témoins intactes. La figure montre les bibliothèques CUT&RUN TF analysées à l’aide d’un instrument d’électrophorèse capillaire.
Les bibliothèques CUT&RUN TF réussies sont enrichies pour les fragments courts de moins de 200 paires de bases. Les bibliothèques CUT&RUN TF sous-optimales montrent l’enrichissement des gros fragments d’ADN. La figure ci-dessous montre que les motifs de liaison à l’ADN Ndt80 sont enrichis dans tous les loci liés à Ndt80 identifiés par CUT&RUN, ce qui indique que les pics supplémentaires identifiés par cette méthodologie sont probablement des sites liés à Ndt80 de bonne foi.
L’analyse comparative a indiqué que le protocole CUT&RUN a identifié la plupart des événements de liaison précédemment connus pour Ndt80 et Efg1 lors de la formation du biofilm. Dans l’ensemble, Ndt80 et Efg1 liés aux loci chevauchent les données ChIP de précipitation immunitaire de la chromatine publiées précédemment et ne sont identifiés qu’à l’aide du CUT&RUN. Cela nous permet d’augmenter considérablement la portée et le rythme de nos recherches axées sur les réseaux de régulation transcriptionnelle et Candida albicans.
