Ce protocole SiMPull permet une quantification de la phosphorylation des protéines en améliorant les conditions de marquage et de fixation des anticorps, en réduisant l’autofluorescence trouvée dans le canal vert et en fournissant des algorithmes d’analyse de molécule unique robustes. Le principal avantage de SiMPull est qu’il nous permet d’interroger le statut de phosphorylation de protéines intactes individuelles. Avec cette méthode, nous pouvons obtenir de nouvelles informations qui ne sont pas accessibles par des techniques traditionnelles, telles que le transfert western et l’analyse des spécifications de masse.
Nous avons une équipe de chercheurs pour aider à démontrer le protocole. Tout d’abord, Julian Rojo montrera comment pirater la gravure du verre de couverture. Rachel Grattan montrera ensuite les étapes de revêtement du verre de couverture.
Et Elizabeth Bailey montrera comment dessiner le tableau et les échantillons d’images. Pour commencer, le piranha grave le couvercle glisse en agitant doucement le bécher réactionnel toutes les cinq minutes pendant 30 minutes. Neutraliser la solution de piranha en ajoutant progressivement une base faible.
À l’aide d’une tige de verre, transférer les couvercles gravés glissés dans un entonnoir Buchner et rincer pendant cinq minutes à l’eau distillée double. Ensuite, placez les feuillets de couverture dans un bocal coplin en verre et couvrez de méthanol. Scellez le couvercle avec un film d’étanchéité et vaporisez le bain pendant 10 minutes.
Après la sonication, videz le méthanol dans une bouteille de stockage en verre. Répétez cette étape avec l’acétone. Rincez le couvercle trois fois avec de l’eau distillée double dans le pot Coplin.
Égouttez l’eau des couvercles et séchez-les en agitant à travers la flamme d’un brûleur Bunsen. Placez les couvercles glissés dans un pot coplin sec. Ajoutez ensuite une solution d’amino silane au pot Coplin pour effectuer une silanisation aminée de couverture.
Couvrir et appliquer un film d’étanchéité pour le protéger de la lumière. Rincez les couvercles avec du méthanol et jetez la solution utilisée. Encore une fois, rincez les feuillets de couverture trois fois avec de l’eau distillée double pendant deux minutes chacun.
Tamponnez l’excès d’humidité et séchez complètement à l’air libre pendant 10 minutes. Ensuite, dessinez un réseau de grilles avec un stylo barrière hydrophobe. Marquez un identificateur sur le bordereau de couverture pour identifier l’orientation appropriée.
Une fois l’encre sèche, placez les feuillets de couverture dans une chambre humidifiée. Remettre en suspension 153 milligrammes de mPEG et 3,9 milligrammes de biotine-PEG dans 609 microlitres de bicarbonate de sodium de 10 millimolaires et vortex. Centrifuger à 10 000 x g à partir d’une minute à température ambiante pour éliminer les bulles.
Appliquez 10 à 15 microlitres de cette solution par carré pour couvrir complètement la matrice sans déborder. Conservez le couvercle glissé dans la chambre d’humidité dans l’obscurité pendant trois à quatre heures à température ambiante. Ensuite, lavez les couvercles en les trempant pendant 10 secondes séquentiellement dans trois béchers remplis d’eau distillée double.
Retirez toute l’humidité des glissières de couverture à l’aide d’azote gazeux. Rangez le couvercle dos à dos dans un tube conique de 50 millilitres rempli d’azote et scellez avec un film d’étanchéité. Enveloppez le tube avec un film d’étanchéité et placez-le à moins 20 degrés Celsius.
Retirez les matrices fonctionnalisées biotine-PEG du congélateur et équilibrez-les à la température ambiante. Placez le couvercle avec le réseau tourné vers le haut sur une boîte de culture tissulaire de 100 millimètres recouverte d’un film d’étanchéité. Incuber chaque carré du réseau avec 10 milligrammes par millilitre de borohydrure de sodium dans du PBS pendant quatre minutes à température ambiante.
Laver trois fois avec PBS. Ensuite, incuber avec 0,2 milligramme par millilitre de NeutrAvidin dans T50 pendant cinq minutes, puis laver trois fois avec T50 BSA. Répétez l’incubation avec deux microgrammes par millilitre d’anticorps spécifique POI biotinylés dans le T50 BSA pendant 10 minutes, suivie d’un lavage.
Tout d’abord, décongeler mélanger le lysat par pipetage. Diluer un microlitre du lysat en 100 microlitres de IPP T50 BSA glacé. Incuber le lysat sur la matrice pendant 10 minutes, puis lavage.
Préparer l’anticorps anti-phosphotyrosine conjugué AF647 dans l’IPP T50 BSA glacé et incuber sur la matrice pendant une heure. Déposez une goutte d’huile sur l’objectif. Placez le nanogrille sur la scène pour l’imagerie.
À l’aide de la lumière blanche transmise, concentrez-vous sur le motif de la grille. Acquérez une série de 20 images de la grille, assurez-vous que les pixels ne sont pas saturés et enregistrez la série d’images comme fiducial. Défocaliser le nanogrille pour créer un motif aéré, acquérir une série de 20 images pour des étalonnages de gain et enregistrer l’image en tant que gain.
Ensuite, acquérez une série de 20 images pour le décalage de la caméra en bloquant toute la lumière de la caméra et enregistrez l’arrière-plan des images. Pour acquérir des images simples, nettoyez d’abord l’objectif d’huile et déposez de l’huile supplémentaire sur l’objectif. Fixez le réseau de glissements de couverture sur la scène du microscope.
Acquérir des images pour chaque échantillon, d’abord dans le canal rouge lointain, suivi de fluorophores de longueur d’onde inférieure. Vérifiez le niveau de tampon toutes les 30 à 45 minutes et réapprovisionnez-le au besoin. En utilisant cette technique, l’EGFR-GFP a été capturé à partir de lysats de protéines totales.
L’autofluorescence de l’encre hydrophobe a été utilisée comme guide pour trouver le plan focal de l’échantillon. Les images de données brutes ont été acquises avec des canaux spectraux séparés sur la puce de la caméra. Une superposition des canaux vert et rouge lointain a été examinée plus avant pour l’acquisition de données.
L’enregistrement des chaînes a été effectué sur des images acquises à partir du nanogrille. Une superposition d’images fiduciales a montré un enregistrement incomplet. L’alignement a été effectué en appliquant une transformation moyenne pondérée locale sur les coordonnées des canaux rouge lointain et vert, qui a été utilisée pour enregistrer les données SiMPull suivantes.
Des émetteurs uniques au-dessus du nombre de photons de fond des canaux GFP et AF647 ont été mis en boîte et une localisation gaussienne a été effectuée pour identifier les emplacements. La colocalisation de l’EGFR-GFP dans un F647 a été réalisée pour identifier les récepteurs phosphorylés. Et le pourcentage de colocalisation a été utilisé pour déterminer la fraction des récepteurs phosphorylés.
Les détections de fond ont été réduites lorsque le verre gravé au piranha a été traité avec du borohydrure de sodium. Une liaison robuste de l’EGFR-GFP dans le lysat a été observée avec une liaison PY99-AF647 non spécifique minimale, montrant une rétention de la fonctionnalisation de surface à l’aide de cette technique. SiMPull fournit des informations sur la phosphorylation des protéines et peut répondre à un large éventail de questions d’auto-signalisation.
Cela peut améliorer notre compréhension de la signalisation dans les états normaux et pathologiques.
