PIB-MS est une nouvelle technique utilisée pour enrichir les phosphatases endogènes de phosphorprotéines et elles interagissent avec les protéines des cellules et des tissus. Il implique l’identification et la quantification de ces protéines à l’aide de la protéomique basée sur la spectrométrie de masse. Cette technique ne nécessite pas l’expression exogène de versions marquées de phosphorprotéines phosphatases qui pourraient modifier l’activité ou la localisation des protéines.
En outre, il n’utilise pas d’anticorps qui pourraient être non spécifiques ou incapables de distinguer entre des isoformes spécifiques. Cette méthode d’étude du PPPM peut être mise à l’échelle pour être utilisée sur tout, des cellules aux échantillons cliniques. Pour commencer, prélever la pastille cellulaire par centrifugation à 277 fois g pendant deux minutes à température ambiante.
Retirez le support et lavez les cellules avec cinq millilitres de PBS. Préparez le tampon de lyse comme décrit dans le protocole de texte et restez sur la glace. Ajouter un millilitre de tampon de lyse réfrigéré aux échantillons, puis homogénéiser les échantillons par sonification et garder les cellules sur la glace entre les impulsions.
Transférer les lysats dans des tubes frais de 1,5 millilitre. Centrifuger l’échantillon sonique à 21, 130 fois g pendant 15 minutes à 4 degrés Celsius. Utilisez une aliquote du lysat pour quantifier la concentration totale en protéines à l’aide d’un test d’acide bicinchoninique.
Cette étape est essentielle pour assurer une concentration égale en protéines dans chaque échantillon. Pour un contrôle de l’inhibiteur de la phosphoprotéine phosphatase, préparer deux aliquotes de concentration égale en protéines pour chaque échantillon. Le tampon de lyse peut être utilisé pour diluer les échantillons afin que chaque tube ait une concentration de protéines égale.
Ajouter un micromolaire de microcystine-LR libre à une aliquote et un volume égal de DMSO à l’autre. Vortex les échantillons et les incuber sur de la glace pendant 15 minutes. La préparation des billes d’inhibiteur de la phosphatase doit être effectuée à l’avance ou pendant les étapes d’incubation décrites dans la section de préparation de l’échantillon.
Utilisez 10 microlitres de billes d’inhibiteurs de la phosphatase solide, ou résine PIB, pour un milligramme de protéine et ajoutez-les à un tube de 1,5 millilitre. Laver les PIB trois fois avec 0,5 millilitre de tampon de lyse par vortex suivi d’une centrifugation à 376 fois g pendant 30 secondes à température ambiante. Ajouter une quantité appropriée de tampon de lyse aux PIB lavés pour obtenir une solution tampon PIB de 50% en volume.
Mélanger en pipetant doucement et faire tourbillonner l’embout de la pipette et la boue pour remettre en suspension les PIBs. Transférer 20 microlitres de la boue dans un tube de 1,5 millilitre contenant 0,5 millilitre de tampon de lyse. Faites tourner les tubes à 376 fois g pendant 30 secondes.
Chaque tube contient des volumes égaux de PIB. Jetez le surnageant tout en ne laissant que la résine solide et jusqu’à 50 microlitres de tampon de lyse dans chaque tube. Transférer les lysats dans les tubes correctement étiquetés contenant des PIB.
Incuber le lysat avec les PIBs pendant une heure à 4 degrés Celsius avec une rotation à 8 tr/min. Après incubation avec le lysat, centrifuger les PIB à 376 fois g pendant 30 secondes à 4 degrés Celsius et retirer le surnageant. Laver les billes en ajoutant 0,5 millilitre de tampon de lyse et en inversant les tubes Recueillir les billes par centrifugation et retirer le surnageant.
Répétez cette étape pour un total de trois lavages. Après le lavage final, retirez le tampon de lyse autant que possible sans pipeter les PIB. Préparez un tampon d’élution contenant 2 % de FDS et ajoutez le tampon d’élution quatre à cinq fois le volume des PIB.
Incuber à 65 degrés Celsius pendant une heure pour éluer les phosphoprotéines phosphatases des perles. Centrifugez les tubes à 376 fois g pendant 30 secondes à température ambiante. Recueillir l’éluat dans un tube séparé et procéder à des analyses de spectrométrie de masse ou à un transfert western.
Pour régénérer les PIB, incubez-les dans une solution SDS à 2% avec rotation à 8 tr/min pendant une heure à température ambiante. Lavez les billes trois à cinq fois en Tris-HCl de 25 millimolaires pH 7,5 avec rotation pendant 30 minutes par lavage. Conservez les PIBs dans 25 millimolaires Tris HCL pH 7,5 avec de l’azoture de sodium.
Pour l’analyse par spectrométrie de masse, les méthodes de filtrage et d’analyse des données varient et peuvent être effectuées par le chercheur ou une installation centrale. Après avoir recherché les données brutes dans une base de données de protéome spécifique à une espèce, filtrez les résultats de la recherche et exportez-les sous forme de feuille de calcul Microsoft Excel. Analysez les données en trois exemplaires.
Pour une quantification sans étiquette, utilisez les mesures de la surface de crête MS1 pour quantifier les données. Pour identifier les sous-unités PPP et leurs interacteurs de novo, comparez les triples biologiques d’échantillons inhibés par la microcystine-LR et traités au DMSO. Filtrer les données de sorte que seules les protéines ayant un nombre total de peptides supérieur à un dans au moins deux des trois échantillons traités par contrôle du DMSO soient présentes.
Pour filtrer les protéines qui ne se lient pas spécifiquement à la résine, éliminez les protéines dans lesquelles le nombre total de peptides dans l’état traité par microcystine-LR est plus élevé que celui de toute sous-unité catalytique PPP. Exclure de l’analyse les contaminants courants tels que la kératine, le collagène, les protéines ribosomiques et les ribonucléoprotéines nucléaires hétérogènes. Un fichier CSV est essentiel pour importer les données dans Perseus.
Importez les données filtrées dans Perseus en cliquant sur Téléchargement de matrice générique dans la section Charger. Transformez les données en accédant à Transformation de base, en sélectionnant les données et en spécifiant la fonction de transformation comme base de journal 2 de x. Imputer les valeurs manquantes d’une distribution normale en accédant à Imputation, Remplacer les valeurs manquantes de la distribution normale, en sélectionnant les données et en spécifiant la largeur et le décalage vers le bas pour le calcul.
Effectuez la normalisation des quantiles en accédant à Normaliser, Normalisation des quantiles. Annotez les données en accédant à Lignes Annot, Lignes d’annotation catégorielles. Effectuez le test T de l’élève en allant dans Tests, Tests à deux échantillons, sélection des groupes, test à effectuer et la méthode de correction des tests d’hypothèses multiples utilisée pour la troncature.
Cette fonction calcule également les ratios log 2. Les phosphotates de phosphoprotéines et leurs interacteurs ont été identifiés dans les cellules HeLa à l’aide d’une expérience de prélèvement PIB, suivie d’une quantification sans étiquette de l’abondance des protéines dans des échantillons traités au DMSO et à la microcystine-LR. Le diagramme volcano de l’analyse par spectrométrie de masse a identifié des liants PIB spécifiques représentés en rouge, des sous-unités catalytiques en bleu et de nouvelles sous-unités PPP candidates, ou protéines en interaction, en blanc.
Les liants non spécifiques étaient représentés en gris. Le nuage de points de la zone log2 du lysat de cellules HeLa traité par DMSO a montré que les abondances étaient fortement corrélées, indiquant la reproductibilité des données. L’analyse en réseau de toutes les sous-unités de phosphorprotéine phosphatase et des protéines en interaction a montré que ces protéines étaient des interacteurs spécifiques dans le tirage du PIB.
Des analyses protéomiques globales pourraient être effectuées et les résultats comparés à l’analyse du FRP pour déterminer si la composition de ppPome est déterminée par l’abondance de PPP ou régulée par des mécanismes post-traductionnels. PIB-MS est un outil largement applicable qui nous a permis d’identifier les différences dans les modèles d’expression du PPP dans diverses conditions telles que les échantillons interphasiques par rapport aux échantillons mitotiques ou les différences entre les lignées cellulaires cancéreuses.
