이 SiMPull 프로토콜은 항체 표지 및 고정 조건을 개선하고 녹색 채널에서 발견되는 자기 형광을 줄이며 강력한 단일 분자 분석 알고리즘을 제공함으로써 단백질 인산화의 정량화를 가능하게합니다. SiMPull의 주요 장점은 개별 손상되지 않은 단백질의 인산화 상태를 조사 할 수 있다는 것입니다. 이 방법을 사용하면 웨스턴 블롯팅 및 질량 사양 분석과 같은 전통적인 기술을 통해 액세스 할 수없는 새로운 정보를 얻을 수 있습니다.
우리는 프로토콜을 시연하는 데 도움이되는 연구원 팀을 보유하고 있습니다. 먼저, 줄리안 로조 (Julian Rojo)는 피라냐가 커버 글라스를 에칭하는 방법을 보여줄 것입니다. Rachel Grattan은 커버 글라스를 코팅하는 단계를 보여줍니다.
엘리자베스 베일리(Elizabeth Bailey)는 배열과 이미지 샘플을 그리는 방법을 보여줄 것입니다. 시작하기 위해, 피라냐는 30분 동안 5분마다 반응 비이커를 부드럽게 교반함으로써 커버 슬립을 에칭한다. 약한 염기를 서서히 첨가함으로써 피라냐 용액을 중화시켰다.
유리 막대로 에칭 된 커버 슬립을 Buchner 깔때기에 옮기고 이중 증류수로 다섯 분 동안 헹구십시오. 그런 다음 커버 슬립을 유리 코플린 병에 넣고 메탄올로 덮으십시오. 뚜껑을 밀봉 필름으로 밀봉하고 10 분 동안 초음파 처리하십시오.
초음파 처리 후, 메탄올을 유리 저장 병에 비우십시오. 아세톤으로이 단계를 반복하십시오. 커버 슬립을 코플린 항아리에 이중 증류수로 세 번 헹구십시오.
덮개 슬립에서 물을 배수하고 Bunsen 버너의 불꽃을 통해 흔들어서 말립니다. 커버 슬립을 마른 코플린 병에 넣으십시오. 그런 다음 아미노실란 용액을 코플린 병에 첨가하여 커버슬립아미노실란화를 수행한다.
빛으로부터 보호하기 위해 밀봉 필름을 덮고 적용하십시오. 덮개 슬립을 메탄올로 헹구고 사용 된 용액을 버리십시오. 다시 커버 슬립을 두 분 동안 이중 증류수로 세 번 헹구십시오.
과도한 수분과 공기를 10 분 동안 완전히 말리십시오. 다음으로, 소수성 장벽 펜으로 그리드 어레이를 그립니다. 표지 슬립에 식별자를 표시하여 적절한 방향을 식별합니다.
잉크가 건조 된 후 커버 슬립을 가습 챔버에 넣으십시오. 153 밀리그램의 mPEG와 3.9 밀리그램의 비오틴-PEG를 10 밀리몰 중탄산나트륨 및 볼텍스의 609 마이크로리터에 재현탁시킨다. 실온에서 1분부터 10, 000 x g에서 원심분리하여 기포를 제거하였다.
제곱 당 10 ~ 15 마이크로 리터의이 용액을 적용하여 오버플로없이 어레이를 완전히 덮으십시오. 커버 슬립을 어둠 속의 습도 챔버에 실온에서 서너 시간 동안 보관하십시오. 그런 다음 커버 슬립을 이중 증류수로 채워진 세 개의 비커에 순차적으로 10 초 동안 담그어 씻으십시오.
질소 가스를 사용하여 커버 슬립에서 모든 습기를 제거하십시오. 커버 슬립을 질소로 채워진 50밀리리터 원뿔형 튜브에 다시 보관하고 밀봉 필름으로 밀봉합니다. 튜브를 씰링 필름으로 감싸고 영하 20도에 놓습니다.
비오틴-PEG 기능화된 어레이를 냉동실에서 제거하고 이를 실온으로 평형화시킨다. 커버 슬립을 어레이를 위로 향하게 하여 밀봉 필름이 늘어선 100밀리미터 조직 배양 접시 위에 놓습니다. 어레이의 각 사각형을 실온에서 4분 동안 PBS 중의 밀리리터당 10밀리그램의 나트륨 보로하이드라이드로 인큐베이션한다.
PBS로 세 번 씻으십시오. 다음으로 T50에서 밀리리터당 0.2밀리그램의 NeutrAvidin으로 5분 동안 인큐베이션한 다음, T50 BSA로 세 번 세척한다. 인큐베이션을 T50 BSA에서 밀리리터당 두 마이크로그램의 비오티닐화 POI 특이적 항체로 10분 동안 반복한 다음, 세척하였다.
먼저, 용해물을 피펫팅하여 혼합한 해동. 용해물 1 마이크로리터를 얼음처럼 차가운 T50 BSA PPI 100 마이크로리터에 희석한다. 용해물을 어레이 상에서 10분 동안 인큐베이션하고, 이어서 세척하였다.
얼음처럼 차가운 T50 BSA PPI에서 AF647 접합된 항포스포티로신 항체를 준비하고, 어레이 상에서 한 시간 동안 인큐베이션한다. 목표에 기름 한 방울을 입금하십시오. 나노 그리드를 이미징 무대에 놓습니다.
전송 된 백색광을 사용하여 그리드 패턴에 중점을 둡니다. 그리드의 일련의 20 개의 이미지를 획득하고 픽셀이 포화되지 않았는지 확인하고 이미지 시리즈를 신탁으로 저장하십시오. 나노그리드의 초점을 해제하여 통풍이 잘되는 패턴을 만들고, 게인 보정을 위해 일련의 20개의 이미지를 획득하고, 이미지를 게인으로 저장합니다.
그런 다음 카메라에 모든 빛을 차단하여 카메라 오프셋을위한 일련의 20 개의 이미지를 획득하고 이미지 배경을 저장하십시오. 간단한 이미지를 얻으려면 먼저 오일 목표를 청소하고 목표에 추가 오일을 입금하십시오. 커버 슬립 어레이를 현미경 스테이지에 고정합니다.
각 샘플에 대한 이미지를 획득하고, 먼저 원-적색 채널에서, 이어서 더 낮은 파장의 형광단을 획득한다. 30~45분마다 버퍼 수준을 확인하고 필요에 따라 보충하십시오. 이 기술을 사용하여, EGFR-GFP를 총 단백질 용해물로부터 포획하였다.
소수성 잉크의 자가형광을 샘플의 초점면을 찾기 위한 가이드로서 사용하였다. 원시 데이터 이미지는 카메라 칩에서 분리 된 스펙트럼 채널로 수집되었습니다. 데이터 수집을 위해 녹색 및 원거리 채널의 오버레이가 추가로 검사되었습니다.
채널 등록은 나노그리드로부터 획득한 이미지에 대해 수행되었다. 신탁 이미지의 오버레이는 불완전한 등록을 보여주었습니다. 정렬은 원간 및 녹색 채널 좌표에 로컬 가중 평균 변환을 적용하여 수행되었으며, 이는 후속 SiMPull 데이터를 등록하는 데 사용되었습니다.
GFP 및 AF647 채널로부터의 배경 광자 수 위의 단일 방출기를 박스화하고 위치를 식별하기 위해 가우시안 현지화를 수행하였다. F647에서 EGFR-GFP의 공동국소화는 인산화된 수용체를 확인하기 위해 수행되었다. 및 공국소화의 백분율을 인산화된 수용체의 분획을 결정하기 위해 사용하였다.
피라냐 에칭된 유리를 나트륨 보로하이드라이드로 처리했을 때 배경 검출이 감소하였다. 용해물에서 EGFR-GFP의 강력한 결합은 최소한의 비특이적 PY99-AF647 결합으로 관찰되었으며, 이 기술을 이용한 표면 기능화의 보유를 보여준다. SiMPull은 단백질 인산화에 대한 정보를 제공하며 광범위한 자기 신호 전달 질문을 해결할 수 있습니다.
이것은 정상 및 질병 상태 모두에서 신호 전달에 대한 우리의 이해를 향상시킬 수 있습니다.
