Cette méthode peut répondre à des questions clés sur la phosphorylation de l’extrémité à cinq premiers des molécules d’ADN ou d’ARN par une classe spéciale d’enzymes connues sous le nom de kinase polynucléotide. Le principal avantage de cette technique est qu’elle a la résolution de détecter de très petits changements dans les substrats d’ADN et d’ARN. Commencez par préparer les réactions de kinase d’enzyme d’ARN.
Pour chaque réaction, combinez un microlitre de substrat d’ARN nanomolaire de 500 nanomolaires. 8,3 microlitres de 130 nanomolaires dernier, GRC trois et 0,2 microlitres de cinq millimolaires EDTA. Réglez le bloc de chaleur à 37 degrés Celsius.
Mélanger ensuite 0,5 microlitres d’un sous-stock ATP de la série de concentration avec un mélange d’enzymes ARN et placer la réaction sur le bloc thermique. Continuer à mélanger les réactions et les placer sur le bloc thermique à intervalles de dix secondes. Après une incubation de 60 minutes sur le bloc thermique, étanchez chaque réaction en la piquant avec 10 microlitres de colorant de chargement d’urée.
Effectuez immédiatement une analyse en aval ou stockez les réactions à 20 degrés Celsius négatifs à analyser à une date ultérieure. Pour préparer une solution de gel acrylamide de 15 %, combinez 22,5 millilitres de solution pré-mélangée de 40%29 à une solution d’acrylamide/bis acrylamide. Six millilitres de dix x TBE.
28,8 grammes d’urée. Et l’eau gratuite RNase à un volume total de 59 millilitres. Puis remuer doucement la solution.
Chauffer la solution au micro-ondes pendant 20 secondes. Remuer et le remettre immédiatement au micro-ondes pendant encore 20 secondes. Remuer délicatement la solution jusqu’à ce que l’urée soit complètement dissoute.
Placez le bécher en verre dans un bain d’eau peu profonde, contenant de l’eau froide pendant cinq minutes, en vous assurant que le niveau d’eau froide entourant le bécher en verre est au-dessus du niveau de solution à l’intérieur du bécher en verre. Lorsque la solution est fraîche, filtrez-la et dé-gazez-la à l’aide d’une unité de filtration jetable de 0,2 micromètre pour éliminer les particules et les bulles d’air microscopiques. Laver une plaque de verre courte et longue avec du savon et de l’eau, puis vaporiser chaque assiette avec 95% d’éthanol et essuyer le verre pour éliminer toute humidité.
Elevez la longue plaque du dessus du banc en la plaçant sur le dessus d’une boîte. Puis placez des espaceurs de 0,4 millimètre le long des longs bords de la plaque. Déposer la plaque courte sur la longue plaque, en s’assurant que les bords de la plaque courte, la plaque longue et les entretentrêteurs sont alignés.
Puis pincez chaque côté avec trois pinces métalliques uniformément espacées. Ajouter 24 microlitres de TEMED à la solution d’acrylamide et mélanger. Ajouter ensuite 600 microlitres de 10% APS et verser immédiatement la solution entre les plaques de verre.
Verser la solution d’acrylamide entre le sandwich à la plaque de verre peut être très difficile. Pour éviter les bulles d’air, appuyez sur le sandwich à la plaque de verre pendant que vous versez votre solution. Ajouter délicatement un peigne propre de 32 puits sur le dessus du sandwich à la plaque de verre.
Et laisser l’acrylamide polymériser pendant 30 minutes. Pour faire fonctionner le gel, réglez le bloc thermique à 75 degrés Celsius. Retirer les pinces métalliques.
Et bien laver et sécher le sandwich plaque de verre. Placez le sandwich à l’assiette et l’appareil de gel avec la plaque courte orientée vers l’avant et préparez 0,5 X TBE tampon de fonctionnement en combinant 100 millilitres de 10 X TBE avec 1,9 litres d’eau libre RNase. Ajouter 600 millilitres de la mémoire tampon en cours d’exécution aux chambres supérieures et inférieures de l’appareil.
Retirer délicatement le peigne du gel et bien rincer les puits à l’aide d’une seringue. Pré-faire fonctionner le gel à 50 Watts pendant 30 minutes. Rincez ensuite les puits à nouveau.
Après faire tourner les réactions de désaltérer et les incuber à 75 degrés Celsius pendant trois minutes. Répétez la rotation des impulsions et chargez immédiatement 10 microlitres de chaque échantillon sur le gel. Ensuite, faire fonctionner le gel pendant trois heures à 50 Watts.
Lorsque la course est terminée, éteignez l’alimentation électrique et videz la chambre haute de l’appareil. Laver et sécher le côté extérieur du sandwich à la plaque de verre. Couvrez-le ensuite de papier d’aluminium et transférez-le à un scanner laser pour l’imagerie.
Montez le sandwich à plaque de verre sur la scène du scanner laser. Réglez les longueurs d’onde d’excitation et d’émission pour le plancher désiré et l’image du gel. Montré ici est un représentant réussi dénaturant gel d’une titration de l’ATP avec une quantité fixe de la grc dernière trois complexe.
L’addition de l’enzyme a eu comme conséquence le dernier clivage 2mété d’ARN du cerevisiae de Saccharomyces ITS deux substrat d’ARN, menant à un fragment défini d’ARN. Lors de l’ajout de l’ATP, le fragment d’ARN C2 a été phosphorylaté par GrC3 PNK. Pour visualiser la phosphorylation du fragment d’ARN C2, la quantité relative d’ARN C2 non phosphorylaté et phosphorylaté a été tracée contre la concentration d’ATP.
Notre représentant gel de dénaturation infructueuse est montré ici. Le substrat d’ARN de 21 nucléotides contenait des produits de dégradation, qui se chevauchaient avec le produit phosphorylaté et rendaient impossible la quantification précise de la phosphorylation. En revanche, le produit de dégradation de l’ARN le plus court a pu être analysé avec succès parce que cette zone du gel ne contenait aucune espèce d’ARN supplémentaire qui empêchait la quantification précise de son homologue phosphorylaté.
La chose la plus importante à retenir lors de la tentative de ce protocole est de rincer les puits du gel pour assurer même le chargement de votre échantillon. Suite à cette procédure, une expérience de rotation de l’ARN pourrait être effectuée. Pour mesurer les taux de dégradation de l’ARN, la phosphorylation signale souvent l’initiation de la dégradation de l’ARN.
Cette technique ouvre la voie à la réponse à des questions détaillées sur la spécificité des activités et la cinétique des kinases polynucléotides.
