Cette étude décrit l’isolement des cellules de l’artère intrapulmonaire et des muscles lisses vasculaires du rat. Plusieurs protocoles expérimentaux ont été utilisés, tels que l’utilisation de la technique du bain d’organes pour étudier la réponse vasculaire de l’artère intrapulmonaire. Les artères intrapulmonaires et les cellules musculaires lisses vasculaires sont d’excellents modèles pour étudier la physiologie vasculaire et la physiopathologie.
Les adaptations de cette technique pourraient évaluer les réponses vasculaires de tout médicament, extrait ou phytochimique. Le montage de l’anneau artériel intrapulmonaire isolé dans un bain d’organes permet d’utiliser des artères intrapulmonaires isolées pour évaluer le rôle d’un médicament dans la modulation de diverses maladies, y compris l’hypertension pulmonaire. Les protocoles expérimentaux sont techniquement réalisables, mais les étapes cruciales sont compliquées et essentielles au succès, de sorte que le fait d’avoir une démonstration visuelle facilite la compréhension et le suivi.
Kittiwoot To-on, étudiante à la maîtrise en physiologie du laboratoire de l’unité de recherche cardiovasculaire, Département de physiologie, Faculté des sciences médicales, Université Naresuan, fera la démonstration de la procédure. Commencez par trancher un seul lobe du poumon avec des ciseaux de 11 centimètres et placez-le sur une boîte de Petri de neuf centimètres avec le côté médial, ou racine du poumon, tourné vers le haut. Observez et identifiez l’alignement de la veine, des bronches et de l’artère de haut en bas.
Couper la bronche longitudinalement avec des ciseaux. Utilisez ensuite les pinces de 11 centimètres pour saisir la pointe de la bronche. Disséquez doucement et retirez les bronches et les veines du poumon.
Utilisez la pince pour saisir l’extrémité de l’artère intrapulmonaire et disséquez-la soigneusement hors du tissu pulmonaire avec des ciseaux. Conserver l’artère intrapulmonaire isolée dans une solution froide de Krebs jusqu’à ce que l’ensemble du bain d’organes soit mis en place. Après avoir isolé l’artère intrapulmonaire, ouvrez la branche principale de l’artère intrapulmonaire longitudinalement avec les ciseaux de 11 centimètres et coupez en bandes de deux millimètres.
Immerger les bandelettes artérielles intrapulmonaires dans DM, puis incuber les bandelettes pendant une heure à quatre degrés Celsius dans DM contenant un milligramme par millilitre de papaïne, 0,04% BSA et 0,4 millimolaire DTT. Puis incuber à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ajouter un milligramme par millilitre de collagénase de type IA dans DM, et incuber à nouveau à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.
Transférer les tissus dans du DM frais et disperser par trituration douce à l’aide d’une pipette Pasteur en verre. Continuez à triturer jusqu’à ce que les cellules musculaires lisses vasculaires isolées deviennent visibles dans la solution de bain au microscope. Isoler l’artère intrapulmonaire comme démontré précédemment et couper la branche principale de l’artère intrapulmonaire en anneaux d’environ deux millimètres de longueur.
Fixez les anneaux de l’artère intrapulmonaire dans les chambres des bains d’organes en les enfilant sur deux fils en acier inoxydable de 40 micromètres de diamètre. Fixez des fils en acier inoxydable montés avec des anneaux artériels intrapulmonaires aux capteurs de force isométriques connectés au dispositif d’acquisition de données et au système informatique installé avec le logiciel physiologique approprié pour l’enregistrement et l’analyse des données. Ensuite, augmentez doucement la tension de l’anneau artériel intrapulmonaire à un gramme.
Laissez les segments du récipient s’équilibrer pendant environ 45 minutes à une tension au repos d’un gramme. Pendant la période d’équilibration, assurez-vous que la solution de Krebs est régulièrement changée toutes les 15 minutes. Après l’équilibre, tester la viabilité des vaisseaux en mesurant leur vasoconstriction à une solution de potassium extracellulaire élevée.
Évaluer la présence ou l’absence d’endothélium en calculant la réponse de relaxation à l’acétylcholine dans les anneaux précontractés avec l’EP. Retirez mécaniquement l’endothélium en frottant doucement l’intérieur du vaisseau avec un petit fil pour provoquer la dénudation. Ensuite, équilibrez les anneaux artériels pendant 30 minutes avant le début des expériences d’essai. Étudier l’effet relaxant de l’extrait de plante en précontractant les anneaux artériels intrapulmonaires avec du PE. Ensuite, ajoutez soigneusement 0,1 à 1000 microgrammes par millilitre d’extrait de plante cumulativement aux cycles intacts de l’endothélium et aux cycles dénudés de l’endothélium pour induire une vasorelaxation et acquérir une courbe de réponse dépendante de la concentration.
S’assurer que le DMSO efficace utilisé comme solvant est également évalué de la même manière pour servir de témoin négatif. Évaluer le mécanisme d’action vasorelaxant de l’extrait de plante tel que mentionné dans le manuscrit du texte. Ensuite, après la stabilisation des contractions au PE, ajoutez des concentrations cumulatives de l’extrait de plante.
Présenter les effets de l’extrait de plante en pourcentage de relaxation des anneaux artériels intrapulmonaires en présence d’inhibiteurs par rapport à la réponse des anneaux artériels intrapulmonaires sans inhibiteurs et construire la courbe concentration-réponse. Dans l’artère intrapulmonaire intacte de l’endothélium, l’extrait de plante a provoqué une réponse de vasorelaxation dépendante de la concentration. L’éradication de l’endothélium a profondément réduit la vasorelaxation induite par l’extrait de plante, comme en témoigne l’augmentation de la CE50 de 2,2 fois, l’inhibition de l’eNOS et de l’EDHF a évidemment diminué la réponse vasorelaxante à l’extrait de plante.
Cela a déplacé la courbe concentration-réponse vers la droite et augmenté la CE50 sans modifier les valeurs E max. Au contraire, l’indométacine n’a montré aucun effet sur la réponse vasorelaxante à l’extrait de plante. Dans les anneaux artères intrapulmonaires dénudés par l’endothélium, les inhibiteurs des canaux potassiques activés par le calcium ont diminué la réponse vasorelaxante à l’extrait de plante.
Alors que les bloqueurs des canaux potassiques voltage-dépendants ou sensibles à l’ATP n’ont montré aucune déviation. La préincubation avec l’extrait de plante a inhibé la contraction induite par le chlorure de calcium. Les anneaux artériels intrapulmonaires dénudés par endothélium préincubés avec une solution de Krebs sans calcium et de l’EP ont provoqué une contraction transitoire.
Par rapport au véhicule, les extraits végétaux ont significativement réduit la contraction induite par le PE. Au cours de la procédure, il faut clairement identifier la veine, les bronches et les artères dès le début. Couper ou endommager l’artère réduira sa longueur et affectera les réponses vasculaires. Cette technique peut être adaptée pour étudier des composés qui pourraient servir de prototypes pour les traitements des maladies vasculaires pulmonaires telles que l’hypertension artérielle pulmonaire.
