Este estudo descreve o isolamento da artéria intrapulmonar de ratos e das células musculares lisas vasculares. Vários protocolos experimentais foram empregados, como o uso da técnica de banho de órgãos para investigar a resposta vascular da artéria intrapulmonar. As artérias intrapulmonares e as células musculares lisas vasculares são excelentes modelos para estudar a fisiologia e a fisiopatologia vasculares.
Adaptações desta técnica poderiam avaliar as respostas vasculares de quaisquer drogas, extratos ou fitoquímicos. A montagem do anel arterial intrapulmonar isolado em um banho de órgão permite o uso de artérias intrapulmonares isoladas para avaliar o papel de uma droga na modulação de várias doenças, incluindo a hipertensão pulmonar. Os protocolos experimentais são tecnicamente viáveis, mas as etapas cruciais são complicadas e essenciais para o sucesso, portanto, ter uma demonstração visual facilita a compreensão e o acompanhamento.
Demonstrando o procedimento estará Kittiwoot To-on, um estudante de mestrado em fisiologia do Laboratório da Unidade de Pesquisa Cardiovascular, Departamento de Fisiologia, Faculdade de Ciências Médicas, Universidade de Naresuan. Comece cortando um único lobo do pulmão com uma tesoura de 11 centímetros e colocando-o em uma placa de Petri de nove centímetros com o lado medial, ou raiz do pulmão, voltado para cima. Observe e identifique o alinhamento da veia, brônquios e artéria de cima para baixo.
Corte o brônquio longitudinalmente com uma tesoura. Em seguida, use a pinça de 11 centímetros para agarrar a ponta do brônquio. Disseque suavemente e remova o brônquio e as veias para fora do pulmão.
Use o fórceps para agarrar a ponta da artéria intrapulmonar e dissecá-la cuidadosamente para fora do tecido pulmonar com uma tesoura. Mantenha a artéria intrapulmonar isolada em solução fria de Krebs até que o conjunto do banho do órgão seja configurado. Após o isolamento da artéria intrapulmonar, corte longitudinalmente o ramo principal da artéria intrapulmonar com a tesoura de 11 centímetros e corte em tiras de dois milímetros.
Imergir as tiras da artéria intrapulmonar em DM e, em seguida, incubá-las por uma hora a quatro graus Celsius em MS contendo um miligrama por mililitro de papaína, 0,04% BSA e 0,4 milimolar DTT. Em seguida, incube a 37 graus Celsius por 15 minutos. Adicione um miligrama por mililitro de colagenase Tipo IA em DM e incube novamente a 37 graus Celsius por cinco minutos.
Transfira os tecidos para DM fresco e disperse por trituração suave usando uma pipeta Pasteur de vidro. Continue triturando até que as células musculares lisas vasculares isoladas se tornem visíveis na solução de banho sob o microscópio. Isole a artéria intrapulmonar, como demonstrado anteriormente, e corte o ramo principal da artéria intrapulmonar em anéis de aproximadamente dois milímetros de comprimento.
Afixe os anéis da artéria intrapulmonar nas câmaras de banho do órgão, enfiando-os em dois fios de aço inoxidável de 40 micrômetros de diâmetro. Anexar fios de aço inoxidável montados com anéis da artéria intrapulmonar aos transdutores de força isométricos conectados ao dispositivo de aquisição de dados e ao sistema de computador instalado com o software fisiológico adequado para registro e análise de dados. Em seguida, aumente suavemente a tensão do anel da artéria intrapulmonar para um grama.
Permita que os segmentos do vaso se equilibrem por cerca de 45 minutos a uma tensão de repouso de um grama. Durante o período de equilíbrio, certifique-se de que a solução de Krebs é trocada regularmente a cada 15 minutos. Após o equilíbrio, testar a viabilidade dos vasos medindo sua vasoconstrição para solução de potássio extracelular alta.
Avaliar a presença ou ausência de endotélio calculando a resposta de relaxamento à acetilcolina em anéis pré-contraídos com EP. Remova mecanicamente o endotélio esfregando suavemente o interior do vaso com um pequeno fio para induzir o desnudamento. Em seguida, equilibre os anéis arteriais por 30 minutos antes do início dos experimentos de teste. Investigar o efeito relaxante do extrato vegetal pré-contraindo anéis da artéria intrapulmonar com EP. Em seguida, adicione cuidadosamente 0,1 a 1000 microgramas por mililitros do extrato da planta cumulativamente aos anéis intactos do endotélio e aos anéis desnudos do endotélio para induzir vasorelaxamento e adquirir uma curva de resposta dependente da concentração.
Certifique-se de que o DMSO eficaz usado como solvente também seja avaliado de forma semelhante para servir como um controle negativo. Avaliar o mecanismo vasorelaxante de ação do extrato vegetal conforme mencionado no texto manuscrito. Em seguida, após as contrações para estabilizar PE, adicione concentrações cumulativas do extrato da planta.
Apresentar os efeitos do extrato vegetal como porcentagem de relaxamento dos anéis da artéria intrapulmonar na presença de inibidores em comparação com a resposta dos anéis da artéria intrapulmonar sem inibidores e construir a curva de concentração-resposta. Na artéria intrapulmonar intacta do endotélio, o extrato da planta provocou uma resposta de vasorelaxamento dependente da concentração. A erradicação do endotélio reduziu profundamente o vasorelaxamento induzido pelo extrato vegetal, como refletido pelo aumento da CE50 em 2,2 vezes, a inibição da eNOS e do EDHF evidentemente diminuiu a resposta vasorelaxante ao extrato vegetal.
Isso deslocou a curva de resposta à concentração para a direita e aumentou a CE50 sem alterar os valores de E máx. Pelo contrário, a indometacina não mostrou efeito sobre a resposta vasorelaxante ao extrato da planta. Nos anéis da artéria intrapulmonar desnudados pelo endotélio, os bloqueadores dos canais de potássio ativados por cálcio diminuíram a resposta vasorelaxante ao extrato vegetal.
Enquanto os bloqueadores dos canais de potássio dependentes de voltagem ou sensíveis ao ATP não apresentaram desvio. A pré-incubação com o extrato da planta inibiu a contração induzida pelo cloreto de cálcio. Os anéis da artéria intrapulmonar desnudados com endotélio pré-incubados com solução de Krebs livre de cálcio e EP renderam uma contração transitória.
Em comparação com o veículo, os extratos vegetais reduziram significativamente a contração induzida pela EP. Durante o procedimento, deve-se identificar claramente veia, brônquios e artéria no início. Cortar ou danificar a artéria reduzirá seu comprimento e afetará as respostas vasculares. Essa técnica pode ser adaptada para investigar compostos que possam servir como protótipos para tratamentos de doenças vasculares pulmonares, como a hipertensão arterial pulmonar.
