SCoPE2 peut quantifier des milliers de protéines provenant de milliers de cellules de mammifères uniques sans anticorps. Ce protocole peut aider à découvrir une hétérogénéité du protéome qui serait autrement invisible pour les analyses en vrac. La protéomique unicellulaire, utilisant l’approche SCoPE2, a été conçue pour être accessible aux chercheurs disposant d’une gamme de ressources, allant d’une simple pipette à la robotique de manipulation de liquides.
SCoPE2 est largement applicable à de nombreux domaines de recherche, y compris le cancer et l’immunologie, en fournissant un aperçu de la façon dont les protéines sont différentielles en abondance entre les cellules individuelles de la même population. Pour commencer, commencez la procédure de lyse cellulaire en plaçant une plaque de 384 puits avec des cellules individuelles triées dans le cycleur thermique, en la chauffant pendant 10 minutes à 90 degrés Celsius, suivie d’un refroidissement à 12 degrés Celsius. Faites tourner brièvement la plaque dans un spinner de plaque de paillasse à 18 à 22 degrés Celsius.
Soniquer la plaque pendant cinq minutes dans un sonicateur au bain-marie à 18 à 22 degrés Celsius. Ensuite, placez-le sur de la glace. Pour procéder à la digestion de la trypsine, préparez 100 microlitres du mélange maître et ajoutez 0,2 microlitre du mélange maître à chaque puits de la plaque de 384 puits à l’aide d’un manipulateur de liquide.
Scellez la plaque, tourbillonnez pendant cinq secondes et faites tourner vers le bas dans une plaque de paillasse à 18 à 22 degrés Celsius. Chauffer la plaque de 384 puits pendant trois heures à 37 degrés Celsius avec la température du couvercle réglée à 52 degrés Celsius. Pour définir une réaction d’étiquetage de masse en tandem, retirez les 85 millimolaires d’étiquettes de masse en tandem du congélateur à moins 80 degrés Celsius.
Avant de les ouvrir, réchauffez les tubes à température ambiante et diluez les étiquettes à 22 millimoles dans de l’acétonitrile anhydre. À l’aide de cette stratégie d’étiquetage, ajoutez 0,5 microlitre d’étiquettes de masse en tandem diluées à chaque puits de la plaque de 384 puits, à l’aide d’un robot distributeur de liquide ou d’une pipette manuelle. Scellez la plaque, tourbillonnez pendant cinq secondes et faites tourner vers le bas dans une plaque de paillasse à 18 à 22 degrés Celsius.
Laissez la réaction d’étiquetage se dérouler à 18 à 22 degrés Celsius pendant une heure. Pour la trempe de la réaction d’étiquetage de masse en tandem, ajouter 0,2 microlitre d’hydroxylamine à 0,5%, dilué dans de l’eau de qualité CLHP, à chaque puits de la plaque de 384 puits à l’aide d’un manipulateur de liquide. Scellez la plaque, tourbillonnez pendant cinq secondes et faites tourner vers le bas dans une plaque de paillasse avant de maintenir la plaque à 18 à 22 degrés Celsius pendant 30 minutes.
La préparation de l’analyse LC-MS commence par retirer le support combiné ou le matériau de référence du congélateur à moins 80 degrés Celsius. Pour chaque ensemble, pipeter un microlitre de support et de matériau de référence dans le premier puits, fera partie d’un seul ensemble. Pipeter le volume complet du premier puits au puits suivant.
Continuer à pipeter le volume complet d’un puits à l’autre jusqu’à ce que tous les puits inclus dans un seul ensemble aient été combinés dans le puits final. Pour chaque ensemble, ajouter cinq microlitres d’acétonitrile à 50% dilué dans de l’eau de qualité CLHP pour le premier puits à cellule unique à inclure dans chaque ensemble. Pipeter le volume complet du premier puits au puits suivant.
Continuez à pipeter le volume complet d’une cellule à l’autre, jusqu’à ce que tous les puits inclus dans un seul ensemble aient été combinés dans le puits final. Maintenant, transférez chaque ensemble dans leurs inserts en verre d’échantillonneur automatique. Sécher les échantillons une fois que tous les ensembles sont combinés et placés dans des inserts en verre.
Avant l’analyse LC-MS-MS, ajoutez 1,2 microlitre d’acide formique à 0,1% à chaque ensemble pour remettre en suspension les peptides marqués. Placez les inserts de l’échantillonneur automatique dans les flacons d’échantillonneur automatique en verre et fermez chaque échantillon avec un bouchon. Vortex chaque flacon pendant cinq secondes pour s’assurer que la remise en suspension est complète, puis tourner vers le bas dans un filateur de flacon à 18 à 22 degrés Celsius.
Assurez-vous que chaque échantillon se trouve au bas de l’insert plutôt que d’être éclaboussé sur les côtés. Placez les flacons dans le plateau de l’échantillonneur automatique et pour chaque ensemble, injectez un échantillon d’un microlitre pour l’analyse LC-MS-MS. L’efficacité de la digestion et du marquage des cellules individuelles peut ne pas être directement dosée comme avec le support, mais le logiciel DO-MS fournit des graphiques qui estiment l’efficacité de la digestion et du marquage.
Une mauvaise digestion est indiquée par un rapport élevé de l’intensité des peptides mal clivés à leurs homologues complètement clivés. Un autre facteur à prendre en compte dans les ensembles est la fraction de données manquantes dans l’intensité médiane des ions reporters dans chaque canal de marquage de masse en tandem. Lorsque des cellules individuelles sont préparées avec succès, les données manquantes par cellule et le contrôle positif sont beaucoup plus faibles que les échantillons de contrôle négatifs.
Une manipulation prudente du liquide pendant la préparation des échantillons LC-MS-MS est essentielle pour une récupération maximale des peptides. De petits échantillons d’environ 100 picogrammes à 100 nanogrammes par puits peuvent être préparés pour l’analyse protéomique à l’aide d’un support isobare. SCoPE2 rend les mesures protéomiques unicellulaires accessibles aux chercheurs du monde entier en utilisant uniquement des réactifs courants et des équipements disponibles dans le commerce.
Il se prête à un traitement manuel ou à une automatisation à haut débit par manipulation robotisée de liquides.
