Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de l’épigénomique en démontrant comment concevoir et mettre en œuvre un outil basé sur le séquençage pour évaluer l’impact des facteurs environnementaux sur la méthylation de l’ADN. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut fournir une méthode plus complète et quantitative pour évaluer les niveaux de méthylation de l’ADN par rapport aux plates-formes basées sur des tableaux. Les implications de cette technique s’étendent à l’identification des changements de méthylation d’ADN dus à différents types de processus physiologiques dans n’importe quel organisme dont les données de séquence sont disponibles.
Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de l’impact du stress sur la méthylation de l’ADN, elle peut également être appliquée à d’autres facteurs environnementaux ou conditions physiologiques, tels que l’exposition à des substances toxiques pour l’environnement dans un régime riche en graisses et des conditions telles que le diabète et les maladies cardiovasculaires. Après avoir cisaillement de l’ADN et vérifié la taille par bioanalyse, ajouter 180 microlitres de perles magnétiques liant l’ADN à chaque échantillon, et incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Pelleter les perles sur une plaque magnétique, et enlever le surnatant.
Resuspendez la pastille dans 200 microlitres de 70% d’éthanol. Ensuite, utilisez une plaque magnétique pour pelleter les perles et enlever autant d’éthanol que possible. Sécher les perles dans un bloc thermique à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes.
Ensuite, resuspendez la pastille dans 44 microlitres d’eau sans nucléase, et recueillez environ 42 microlitres du supernatant. Après avoir ligating les adaptateurs et la vérification de la ligature par bioanalyse, transférer les échantillons à faible teneur en tubes de microcentrifugeuse liant l’ADN. Ensuite, utilisez un concentrateur à vide chauffé pour réduire le volume de l’échantillon en dessous de 3,4 microlitres.
Après cela, ajouter 5,6 microlitres de Mélange bloc Méthyl-Seq à chaque échantillon, et les incuber dans un cycleur thermique. Préparez capture bibliothèque hybridation Mix selon le protocole de texte. Ensuite, ajoutez 20 microlitres de Capture Library Hybridization Mix à chaque échantillon et incubez à 65 degrés Celsius pendant 16 heures.
Vers la fin de la période d’incubation, préparer des perles magnétiques streptavidines en ajoutant 50 microlitres de perles magnétiques streptavidin par échantillon à un nouveau tube à bande de huit puits. Lavez les perles avec 200 microlitres de tampon de liaison Méthyl-Seq. Placez le tube à bande sur une plaque magnétique et retirez le surnatant des perles.
Puis, réutilisez les perles dans 200 microlitres de Methyl-Seq Binding Buffer. Ajouter les échantillons aux perles de streptavidine lavées et les incuber à température ambiante pendant 30 minutes sur un mélangeur rotatif. Pendant que les échantillons se mélangent, aliquot 200 microlitres de Methyl-Seq Wash Buffer Deux dans des puits de triplicate d’une plaque de 96 puits et préchauffés à 65 degrés Celsius.
Après l’incubation des échantillons, pelleter les perles magnétiques avec une plaque magnétique et enlever le supernatant. Ensuite, réutilisez les perles dans 200 microlitres de Methyl-Seq Wash Buffer One. Incuber les perles pendant 15 minutes à température ambiante, et utiliser une plaque magnétique pour enlever le supernatant.
Après cela, réutilisez la pastille de perles dans 200 microlitres de Wash Buffer Two préchauffé. Ensuite, incuber les perles dans un cycleur thermique avant d’utiliser une plaque magnétique pour pelleter les perles. Ajouter 20 microlitres de tampon d’elution Méthyle-Seq aux perles lavées et les incuber à température ambiante pendant 20 minutes.
Utilisez une plaque magnétique pour pelleter les perles et transférez le supernatant dans un nouveau tube à bande. Tout d’abord, ajouter 130 microlitres de réaccente de conversion de bisulfite au supernatant précédemment recueilli. Divisez également les réactions de 150 microlitres en deux puits.
Puis, incuber les réactions dans un cycleur thermique. Utilisez 600 microlitres de tampon de liaison pour lier les échantillons aux colonnes de spin, et lavez les colonnes avec 100 microlitres de Wash Buffer. Ensuite, centrifugez les colonnes et jetez le flux.
Après cela, ajouter 200 microlitres de tampon de désulphonation aux colonnes. Incuber les colonnes pendant 15 à 20 minutes à température ambiante. Lavez les colonnes deux fois avec 200 microlitres de Wash Buffer.
Ensuite, ajoutez 10 microlitres d’Elution Buffer à la colonne. Incuber à température ambiante et centrifugeuse. Préparez le mix maître de réaction PCR selon le protocole de texte.
Ajouter ensuite 82 microlitres du mélange principal à chaque échantillon et incuber les échantillons dans un cycleur thermique. Tout d’abord, préparez le PCR Master Mix Two sur glace selon le protocole du texte. Ensuite, à chaque échantillon, ajouter 25,5 microlitres de PCR Master Mix Two et cinq microlitres d’amorces d’indexation commerciales, et incuber les échantillons dans un cycleur thermique.
Évaluer la concentration d’ADN des échantillons avec des réhésifs de détection d’ADN à haute sensibilité sur un bioanalyseur. Les bibliothèques Methyl-Seq sont ensuite soumises pour séquençage sur le séquenceur de nouvelle génération. Après la conversion de la bisulfite et l’amplification des échantillons de validation pcr, préparez un mélange principal avec des perles de sepharose enduites de sépharose liant buffer, d’eau et de streptavidine.
Ajouter ensuite 75 microlitres du mélange principal et cinq microlitres du produit PCR imbriqué dans une assiette de 96 puits, et secouer la plaque sur un shaker pendant 15 à 60 minutes. Pendant que la plaque tremble, ajouter 12 microlitres d’amorce aux puits d’une plaque d’essai de pyrosequencing. Après avoir secoué, placez un outil de vide dans une cuvette remplie d’eau, puis placez l’outil dans la plaque avec des réactions contraignantes.
Ensuite, submergez l’outil sous vide dans des auges à moitié remplies contenant 70 % d’éthanol, d’hydroxyde de sodium et de tampon d’acétate de tris. Déconnecter le vide, et placer l’outil de vide dans la plaque d’analyse de pyrosequencing HS pour transférer les perles. Placer la plaque sur un bloc thermique et incuber à 80 degrés Celsius pendant deux minutes.
Enfin, laisser refroidir la plaque pendant cinq minutes avant de commencer le programme pyro. Dans ce protocole, l’analyse des bibliothèques Méthyl-Seq a fourni une liste classée des régions différemment méthylées, ou DMR, entre les animaux stressés et non stressés et une parcelle graphique des DMR. Validation par pyrosequencing bisulfite a montré que les animaux stressés présentaient tous des niveaux de méthylation plus élevés dans tous les CPG que les animaux non stressés.
Les niveaux de méthylation au CpG 10 ont également été comparés aux niveaux moyen de CORT de trois semaines pour chaque animal. Les résultats indiquent qu’il existe une corrélation modeste entre les données endocriniennes et méthylation. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de comparer l’augmentation de la taille moyenne d’ADN entre les étapes de cisaillement d’ADN et de ligature d’adaptateur et d’assurer la quantité suffisante de bibliothèque avant le séquençage.
À la suite de cette procédure, d’autres approches similaires peuvent être mises en œuvre afin de répondre à de nouvelles questions, telles que l’impact des substances toxiques environnementales sur le neurodéveloppement des rats. Après son développement, cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine de l’épigénétique d’explorer les changements de méthylation de l’ADN à l’échelle du génome dans tous les organismes non modèles ou modèles où des séquences génomiques sont disponibles. N’oubliez pas que le travail avec les enzymes sensibles à la température nécessite un stockage sur la glace pendant l’utilisation et l’entreposage dans le congélateur à moins 20 degrés.
Les perles d’ARN utilisées pour la capture des cibles nécessitent le dégel et l’entreposage sur la glace pendant leur utilisation et leur stockage à long terme dans le congélateur à moins 80 degrés.
