La façon dont les cellules maintiennent l’homéostasie des protéines n’est pas bien comprise dans le contexte du stress cellulaire et de la sénescence. Dans ce protocole, nous fournissons un moyen simple et précis de calculer le renouvellement des protéines, qui est un élément clé de l’homéostasie des protéines dans les cellules vivantes. Pulse SILAC donne à un expérimentateur la capacité de mesurer le renouvellement des protéines pour des protéines individuelles et l’ensemble du protéome d’une manière à haut débit qui est également plus authentique pour les systèmes biologiques que d’autres méthodes.
Les principes de cette méthode peuvent être appliqués à tout système pouvant être marqué métaboliquement, y compris les organismes entiers. Cette méthode peut également conduire à des connaissances sur la sénescence cellulaire, le vieillissement et les maladies neurodégénératives. L’analyse par spectrométrie de masse est très sensible à certains contaminants chimiques, tels que les détergents.
Utilisez des réactifs de qualité LC-MS tout au long de cette procédure pour garantir une collecte de données de haute qualité. Pour commencer le marquage métabolique des cellules, remplacez le milieu pour trois plaques de cellules sénescentes et quiescentes chacune par 30 millilitres de milieux SILAC Light. Séparément, remplacez le milieu pour trois plaques sénescentes et trois plaques de repos par 30 millilitres de SILAC Heavy.
Cultivez les cellules pendant trois jours sans changer le milieu. Pour détacher les cellules des plaques de culture, ajoutez cinq millilitres de réactif de trypsine préchauffé à chaque plaque et incubez les plaques pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Plus tard, ressuspendez les cellules détachées dans cinq millilitres du même milieu utilisé pour la culture à un volume total de 10 millilitres.
Ensuite, transférez les cellules dans la glace et centrifugez les cellules à 300 fois G à quatre degrés Celsius. Après avoir lavé la pastille deux fois, faites tourner à nouveau les cellules et retirez le surnageant avant de remettre la pastille dans 150 microlitres d’urée à huit molaires fraîchement préparée et de tampon de lyse de bicarbonate d’ammonium de 50 millimolaires. Mélanger le contenu du tube en pipetant de haut en bas.
Aliquote 50 microgrammes de l’échantillon de protéine dans un nouveau tube et amène les échantillons à des volumes égaux avec un tampon de lyse. Ensuite, ajoutez le dithiothréitol à une concentration finale de 20 millimolaires dans le tube et incubez l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes en agitant. Laisser refroidir l’échantillon à température ambiante pendant 10 minutes avant d’ajouter l’iodoacétamide à une concentration finale de 40 millimolaires et d’incuber à température ambiante dans l’obscurité pendant 30 minutes.
Diluer ensuite l’échantillon en dessous d’urée d’une molaire avec un tampon de bicarbonate d’ammonium de 50 millimolaires. Ajouter un microgramme de trypsine pour 50 microgrammes de protéine de départ ou à 1:50 trypsine / rapport protéine à l’échantillon. Incuber l’échantillon pendant la nuit à 37 degrés Celsius en agitant pour digérer les protéines en peptides.
Le lendemain, ajoutez de l’acide formique à 1% en volume de l’échantillon pour éteindre la digestion des protéines. Pour le nettoyage de l’échantillon, placez une cartouche d’extraction en phase solide sur un collecteur à vide, en utilisant une cartouche d’extraction pour chaque échantillon, conformément aux directives du fabricant. Après l’extraction, retirez les échantillons de peptides du collecteur à vide et séchez-les complètement dans un concentrateur à vide.
Le séchage prend environ trois heures. Pour la spectrométrie de masse, ou analyse MS, remettez en suspension l’échantillon peptidique à une concentration de 400 nanogrammes par microlitre dans un tampon d’acide formique à 0,2%. Pour resolubiliser les peptides, mélanger l’échantillon pendant cinq minutes.
Ensuite, soniquez pendant cinq minutes dans un sonicateur au bain-marie. Ensuite, centrifugez l’échantillon pour granuler les matériaux insolubles et transférez les surnageants peptidiques dans des flacons de SEP. Soumettre les échantillons pour l’analyse protéomique en utilisant la spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide, ou LC-MS-MS.
Utilisez les paramètres recommandés pour l’analyse non ciblée par l’installation de spectrométrie de masse. Chargez les échantillons sur une colonne analytique avec un débit de 400 nanolitres par minute pour éluer les peptides sur un gradient linéaire de 90 minutes à l’aide d’un mélange de solvants organiques et inorganiques, le solvant organique allant de 5 à 35% Acquérir des données de spectrométrie de masse en mode dépendant des données, avec un cycle continu de scans d’enquête MS1 suivis de 20 scans MS2 dépendants des données avec fragmentation HCD. Quantifier les zones de pic peptidique pour les peptides lourds et légers dans l’outil logiciel de quantification du protéome.
Ensuite, exportez les zones de pic peptidique lourdes et légères. Pour le calcul des demi-vies des protéines, ouvrez le classeur d’analyse SILAC à la première feuille intitulée Données brutes et collez les ID UniProt, les noms de gènes, les zones de pic lourd et léger dans les colonnes indiquées. Ensuite, ouvrez la quatrième feuille nommée Analyse et supprimez les lignes où les colonnes G et H indiquent que l’échantillon est hors plage et conservez les lignes lues dans la plage.
Les phénotypes sénescents ont été validés à l’aide de l’activité de la bêta-galactosidase associée à la sénescence et de l’analyse RT-qPCR. Pour l’activité de la bêta-galactosidase, les cellules sénescentes apparaissaient bleues, tandis que les cellules témoins au repos n’avaient pas ou peu de couleur. Dans l’analyse RT-qPCR, les cellules sénescentes ont montré des ARNm d’interleukine-6, CXCL8 et CDKN1A-P21 plus élevés que les cellules quiescentes.
Inversement, le niveau de codage de la lamine B1 pour le marqueur de prolifération était faible ou absent dans les cellules sénescentes. Les chromatogrammes ioniques extraits des peptides ont révélé la proportion relative de signaux peptidiques lourds et légers. Une proportion plus faible de signaux peptidiques lourds par rapport aux cellules sénescentes légères indiquait un taux de renouvellement des protéines plus lent, et un signal peptidique lourd plus élevé par rapport à la lumière indiquait un taux de renouvellement des protéines plus rapide.
Les échantillons non marqués ont montré peu ou pas de signal peptidique lourd. Les demi-vies de 695 protéines identifiées à partir de l’analyse par spectrométrie de masse ont été calculées. La demi-vie est rapportée comme un rapport log-deux de cellules sénescentes sur des cellules quiescentes et tracée dans une parcelle de volcan.
Après le calcul des taux de renouvellement des protéines dans les cellules sénescentes, l’analyse en aval peut révéler des voies biologiques candidates régulées par des mécanismes de protéostasie. Pulse SILAC a ouvert la voie aux chercheurs pour étudier la dynamique des protéines avec une granularité et un débit sans précédent, ce qui nous a permis d’étudier les changements dans l’homéostasie des protéines dans de nombreuses protéines individuelles.
