Notre protocole permet de mesurer le taux d’autophagie et d’activité protéasomale dans les tissus de souris et est suffisamment sensible pour détecter les variations circadiennes au sein de ces activités. Cette technique peut être utilisée in vivo pour évaluer le catabolisme protéique dans les cellules et les tissus et les matériaux requis sont relativement peu technologiques et accessibles à n’importe quel laboratoire de biologie moléculaire. Mikhaïl Ryzhikov, post-doc de mon laboratoire, démontrera la procédure.
Pendant quinze minutes avant chaque point de temps, réchauffer les solutions de bouillon de leupeptine et de bortézomib à température ambiante et diluer le bortézomib décongelé dans un PBS stérile pour produire une solution de travail de 50 milligrammes par millilitre. Pour l’administration d’inhibiteurs de la protéase, injectez intrapétoneally 40 milligrammes par kilogramme de leupeptine ou 1,6 microgramme par kilogramme de bortézomib dans chaque animal expérimental. Pour un contrôle négatif, injecter aux souris 0,5 millilitres de PBS.
Retournez chaque souris dans des cages regroupées par le type de traitement reçu au fur et à mesure qu’elles sont injectées et enregistrez le temps pendant laquelle les souris sont traitées ou manipulées dans une table normalisée. Deux heures après l’injection, submergez le lobe hépatique gauche récolté de chaque animal expérimental sacrifié dans sept millilitres de tampon d’homogénéisation glacée dans des tubes coniques de 15 millilitres dûment étiquetés sur la glace. Lorsque tous les échantillons ont été acquis, transférer le premier échantillon et l’ensemble du volume du tampon d’homogénéisation dans un homogénéisateur Dounce de 15 millilitres de capacité et homogénéiser l’échantillon avec 10 coups du piston lâche et 15 coups du piston serré.
Retournez l’homogénéité brute qui en résulte à son tube d’origine et homogénéisez l’échantillon suivant comme nous venons de le démontrer. Lorsque tous les échantillons ont été homogénéisés, sédimenter les noyaux homogénéisés et les débris par centrifugation et transférer les quatre millilitres les plus hauts de chaque supernatant post-nucléaire dans de nouveaux tubes de 15 millilitres. Déterminer la concentration protéique de cette première fraction supernatante selon les protocoles standard et égaliser les concentrations de tous les échantillons à 2,1 milligrammes par millilitre avec tampon d’homogénéisation fraîche au besoin.
Pour l’analyse en aval et l’amélioration de la qualité, aliquot 500 microlitres des fractions de protéines totales normalisées en tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre pour un stockage de moins 80 degrés Celsius. Transférer 1,5 millilitres de chacune des fractions de protéines totales restantes dans des tubes de microcentrifugeuses individuels et granuler les échantillons de protéines par centrifugation. Transférer un millilitre des supernatants de deuxième fraction qui en résultent dans de nouveaux tubes de microcentrifugeuse sur la glace et aspirer les supernatants restants.
Lavez les granulés 3K deux fois dans 1,5 millilitres de tampon d’homogénéisation froide fraîche par lavage, puis réutilisez la pastille 3K dans 200 microlitres de tampon d’échantillon SDS-PAGE et faites bouillir les échantillons à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Faites tourner les supernatants de la deuxième fraction pendant 20 minutes à 20 000 x g et quatre degrés Celsius et transférez les supernatants de la troisième fraction cytoplasmique qui en résultent dans un nouveau tube de microcentrifugeuse. Pour l’analyse SDS-PAGE, combinez 150 microlitres de la fraction cytoplasmique avec 50 microlitres de tampon d’échantillon 4x SDS-PAGE et faites bouillir les échantillons de fraction cytoplasmique à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes.
Aspirez le supernatant restant des granulés de 20 000 et lavez les échantillons deux fois avec 1,5 millilitres de tampon d’homogénéisation froide fraîche par lavage. Puis résuspendez la pastille de 20 000 dans 100 microlitres de tampon d’échantillon SDS-PAGE pour faire bouillir à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Pour l’analyse des taches occidentales, diluez périodiquement les protéines courbes standard s’érifiant d’un à trois dans un tampon d’échantillon 1x pour un total de six dilutions et chargez 10 microlitres de chaque échantillon de courbe standard dans un puits d’un gel midi 26 well four to 12%SDS-PAGE, puis chargez une norme de poids moléculaire commercial prétachée.
Pour mesurer le flux autophagique, chargez 12 microlitres de chaque échantillon de granulés de 3K dans les puits appropriés. Pour mesurer le flux protéasomal, chargez 12 microlitres de chaque fraction cytoplasmique dans les puits appropriés. Lorsque tous les échantillons de contrôle et expérimentaux ont été chargés, séparez les échantillons de protéines par SDS-PAGE avant de transférer les protéines aux membranes de fluorure polyvinylidene selon les protocoles standard.
Pour analyser le flux macroautophagique, les membranes de tache contenant les échantillons de granulés 3K avec anti-p62 ou anticorps anti-LcB pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Pour analyser le flux protéasomal, les membranes de tache contenant les échantillons de fraction cytoplasmique avec l’anti-lysine 48-Spécifique anticorps de poly ubiquitine pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Imagez ensuite les taches occidentales à l’aide d’anticorps secondaires standard et de dispositifs d’imagerie.
Pour effectuer des mesures densitométriques sur les bandes d’intérêt pour la courbe standard et les échantillons expérimentaux, ouvrez un logiciel d’analyse d’image approprié et dessinez un long rectangle englobant le monomère protéique d’intérêt au bas de l’image de tache s’étendant jusqu’au sommet de la membrane. Copier et coller pour déplacer le rectangle vers les échantillons restants, en gardant le rectangle cohérent entre les échantillons. Enregistrez la quantification sur une feuille de calcul et générez une courbe standard densitométrique dans la feuille de calcul à l’aide de l’échantillon standard dilué en série dans une régression linéaire ou polynomiale afin d’obtenir une équation de courbe standard la mieux adaptée.
À l’aide de cette équation, extrapoler la quantité de monomères d’intérêt dans les échantillons expérimentaux. Pour obtenir des mesures de flux, soustrayez la quantité de protéines extrapolée de chaque échantillon traité par inhibiteur de la valeur moyenne des échantillons de PBS à partir du même point de temps. Évaluez ensuite la signification statistique de la variation temporelle du chiffre d’affaires des protéines à l’aide d’ANOVA uni-sens.
La lecture primaire pour le flux autophagique à n’importe quel point de temps donné est la différence dans la quantité de marqueurs spécifiques de macroautophagy entre la leupeptine traitée contre les échantillons factices dans la fraction 3K lysosome-enrichie de granule divisée par deux. En règle générale, les résultats sont normalisés à la moyenne qui simplifie la comparaison entre les expériences indépendantes. Notre procédure de mesure du flux protéolytique dépend de la capacité de la leupeptine ou du bortézomib à provoquer l’accumulation de substrats autophagie et protéasome, qui est un processus dépendant du temps.
Cette technique a permis d’explorer comment les rythmes biologiques programment le catabolisme des protéines hépatiques. Nous espérons qu’il ouvrira la voie à l’étude des effets de la maladie sur les fonctions d’entretien ménager cellulaire.
