Ce protocole permet d’observer de nombreux phénomènes neurophysiologiques qui ne sont pas bien compris, tels que le transfert de bloc nerveux après une injection de courant à haute fréquence / haute amplitude, tout en empêchant les interférences d’autres processus dans un corps vivant. Cette technique donne des résultats hautement reproductibles et robustes et est plus pratique que l’électrophysiologie in vivo, car des variables complexes telles que la profondeur de l’anesthésie n’ont pas besoin d’être contrôlées et ne peuvent donc pas influencer les mesures. Après une procédure d’euthanasie sous anesthésie, placez un rat femelle sur la table de dissection, tenez fermement la cheville entre le pouce, l’index et le majeur et coupez le tendon calcanéen à l’aide de ciseaux contondants droits de 12 centimètres.
À l’aide de pinces fines et de ciseaux, faites des incisions minutieuses à travers les couches musculaires près du milieu de l’arrière de la jambe jusqu’à ce que le nerf sciatique soit exposé. Une fois que le nerf est visible, hydratez la cavité à l’aide d’un tampon Krebs-Henseleit modifié par le froid glacial, ou MKHB, pour empêcher le nerf de se dessécher. À l’aide d’hémostats, tirez les lambeaux de peau de chaque côté et maintenez l’incision ouverte pour une dissection plus fine.
En partant de l’emplacement de l’incision du tendon calcanéen, à l’aide de ciseaux fins, interrompez le muscle du côté médian de la jambe pour libérer le nerf. Continuez à maintenir les niveaux d’humidité dans la région avec du MKHB glacé. Lorsque le nerf est exposé tout en remontant la jambe, disséquez le tissu musculaire sus-jacent.
Libérez le nerf plus près de la colonne vertébrale des tissus conjonctifs jusqu’à atteindre la fente vertébrale, auquel cas il y a un pli dans le nerf. Ne nettoyez pas encore le nerf, car la vitesse est essentielle à ce stade. Pour faciliter la dissection, à l’aide d’une pince, tirez doucement l’extrémité du nerf près de la cheville.
Ensuite, à l’aide de ciseaux fins, gravez le nerf près de la colonne vertébrale. Placez le nerf disséqué dans un tube centrifuge de 15 millilitres rempli de MKHB et replacez le tube sur la glace jusqu’au début de la procédure de nettoyage. Remplissez la boîte de Petri enduite à mi-chemin avec du MKHB oxygéné réfrigéré, puis placez un nerf sciatique disséqué dans le plat et épinglez les deux extrémités du nerf au plat de sorte que le nerf soit droit sans plis, torsion ou torsions.
À l’aide de sutures de soie 6-0 ou d’un fil fin, nouez un double nœud autour de chaque extrémité du nerf pour éviter les fuites de cytosol dans le tampon. Placez les nœuds juste à côté des épingles à insectes sur le côté plus près du centre du nerf pour éviter les fuites du tissu nerveux dans le tampon. Au microscope, à l’aide de ciseaux à ressort inclinés de deux millimètres et de pinces fines, retirez la graisse, les vaisseaux sanguins et le tissu musculaire du nerf.
Taillez toutes les branches nerveuses qui ne seront pas utilisées dans la stimulation et l’enregistrement. Après toutes les cinq minutes de nettoyage, remplacez le tampon par du MKHB frais, réfrigéré et oxygéné. Après le nettoyage, replacez le nerf dans le tube de transport rempli de tampon et reposez le tube sur de la glace.
Préparez un bain nerveux propre à double chambre. À l’aide de têtes de bossage et de pinces de laboratoire standard, placez le bain nerveux sous le niveau de la bouteille de deux litres placée sur l’agitateur chauffant. Connectez le drain du bain à l’entrée de la pompe péristaltique.
Connectez la sortie de la pompe péristaltique à un tube renvoyant au flacon tampon. Connectez l’entrée de bain à un tube avec une soupape de débit réglable et placez le tube à l’intérieur de la bouteille. Utilisez une valve à trois voies avec une seringue connectée à la sortie centrale pour aider à amorcer le tube en tant que siphon pour l’entrée de tampon assistée par gravité.
Amorcer le siphon en tirant la seringue jusqu’à ce que le tampon s’y écoule. Configurez la vanne de telle sorte que le débit tampon dans le bain soit de cinq à six millimètres par minute. Le débit peut être augmenté initialement pour remplir le bain.
Une fois que le niveau de tampon du bain a atteint le drain, placez les nerfs dans le bain. À l’aide d’une épingle à insectes, fixez l’extrémité du nerf au coin de la chambre de bain remplie de tampons. À l’aide de pinces fines inclinées à 45 degrés et en pinçant le nerf uniquement aux extrémités, enfilez soigneusement le nerf à stimuler à travers le trou dans la cloison entre les deux chambres de bain.
À l’aide d’une épingle à insectes, fixez l’autre extrémité du nerf dans la chambre à huile du bain, en veillant à ce que le nerf soit droit sans être étiré et exempt de plis et de torsions. À l’aide de graisse de silicone, faites un joint pour éviter les fuites de tampon de la chambre tampon dans la chambre à huile Remplissez la chambre d’huile avec du silicone ou de l’huile minérale. Placez les crochets d’électrode d’enregistrement argent/chlorure d’argent dans la chambre à bain d’huile et fixez-les à l’aide de têtes de bossage et de pinces.
Ensuite, drapez la partie du nerf dans le bain d’huile sur les crochets sans tirer le nerf tendu. Ajustez ou réparez le joint de graisse en silicone si une fuite est observée après avoir déplacé le nerf. Connectez l’électrode de référence en argent/chlorure d’argent à la masse de l’amplificateur et placez l’électrode dans la chambre de bain remplie de tampons en la fixant à l’aide d’une pince de laboratoire.
Après avoir préparé une électrode de brassard nerveux propre pour la stimulation, placez l’électrode dans la chambre de bain remplie de tampon. À l’aide d’une pince ou d’une pince à épiler fine avec des pointes émoussées ou inclinées, ouvrez l’électrode dans le bain pour mouiller l’intérieur du brassard. S’il reste des bulles, utilisez une seringue fine pour extraire le tampon du bain et forcez les bulles à sortir du brassard.
À l’aide d’une pince, ouvrez doucement le brassard et faites-le glisser sous le nerf. Fermez le brassard autour du nerf, en évitant tout pli ou torsion du nerf. Connectez l’électrode de stimulation et l’électrode de retour de courant au stimulateur.
Si vous utilisez une feuille de platine carrée comme électrode de retour de courant, placez la feuille loin du nerf dans le bain. Fixez le fil des deux électrodes avec du ruban adhésif. Connectez la sortie du signal TTL du stimulateur au canal quatre de l’oscilloscope.
Sur l’écran de l’oscilloscope, appuyez sur l’onglet Canal de déclenchement et spécifiez le canal quatre comme canal de déclenchement. Réglez le niveau de déclenchement sur un volt à l’aide du bouton de niveau. Sur l’oscilloscope, réglez la résolution temporelle à une milliseconde par division et la résolution de tension à 10 millivolts par division.
Centrez la référence du déclencheur dans le temps et réglez le niveau du déclencheur sur un volt. Après avoir connecté le stimulateur à l’ordinateur, allumez le stimulateur en connectant l’alimentation de la batterie à l’entrée d’alimentation. Ensuite, démarrez le logiciel MATLAB sur l’ordinateur.
Exécutez le script MATLAB personnalisé. Ensuite, ouvrez le script MATLAB indiqué. Modifiez le script et définissez les paramètres amplitude de l’impulsion du stimulateur à moins 300 microampères, la largeur de l’impulsion du stimulateur à 300 microsecondes, le nombre d’impulsions du stimulateur à 10 et le temps du stimulateur entre les impulsions à une seconde.
Démarrez le protocole de stimulation en cliquant sur Exécuter dans le logiciel. Le potentiel d’action du composé, ou CAP, avait une amplitude de crête à crête d’un millivolt à l’électrode et de 100 millivolts lorsqu’il était amplifié. L’excitabilité nerveuse typique des poignets nerveux en platine standard et des poignets nerveux en élastomère conducteurs sur mesure est montrée ici.
Le CAP obtenu ex vivo au cours d’une journée d’expériences utilisant les deux nerfs sciatiques est montré ici. Une réduction minimale de l’amplitude de la CAP a été observée avec le nerf sciatique droit. En revanche, l’amplitude cap du nerf sciatique gauche à environ trois millivolts était similaire à celle du nerf sciatique droit au début de l’expérience plus de six heures après l’extraction nerveuse.
Mettez l’accent sur la précision et la répétabilité dans la technique de dissection, de nettoyage et de mise en œuvre. Faites attention à ce qui se passe dans le bain. Si le signal nerveux est perdu, il se peut simplement que les électrodes ne soient pas en bon contact ou qu’il y ait une solution saline dans la cloison de l’huile de bain, et non que le nerf soit mort.
Les nouveaux utilisateurs peuvent être tentés de se précipiter, en particulier pendant la phase de dissection. Cela conduira probablement à des erreurs et endommagera le nerf. La précision et la cohérence sont essentielles ici et conduiront à des résultats de meilleure qualité.
Une attention particulière devrait également être accordée à la cohérence dans la préparation du tampon.
