Ce protocole utilise des enregistrements intracellulaires de motoneurones rachidiens, pour étudier directement l’influence de la stimulation trans-spinale du courant direct sur la fonction des réseaux rachidiens. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’effectuer des enregistrements intracellulaires sur un système nerveux mature. Faciliter la traduction des observations expérimentales à des applications pratiques.
Après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de la pédale, un rat Wistar mâle anesthésié de six mois, utilisez un microscope disséquant et une lame numéro 21, pour faire une incision longitudinale de la peau du sternum au menton. Et utilisez la dissection émoussée pour exposer la veine jugulaire droite. Placez deux ligatures de 4 à 0 sous la section de la veine sans ramer les points.
Et faire un nœud lâche sur l’extrémité proximale du segment veineuse. Et un nœud lâche sur l’extrémité distale du segment. Serrez la veine proximale au coeur, et ligate l’extrémité distale de la veine.
Utilisez des ciseaux d’iris pour faire une incision entre la pince et la ligature distale. Et, tenant un rabat de la veine, introduire un cathéter pré-rempli au point où la veine est bloquée par la pince. Retirez ensuite la pince et poussez le cathéter plusieurs millimètres dans la veine.
Pour un placement de tube trachéal, utilisez des forceps contondants pour séparer les deux glandes mandibulaires couvrant les muscles sternohyoid. Et séparez les muscles sternohyoid à la ligne médiane, pour exposer la trachée. Placez trois ligatures de 4 à 0 sous la trachée et faites deux nœuds sous le point d’insertion du tube trachéal et un nœud au-dessus.
Puis insérez un tube trachéal dans la trachée sous le troisième cartilage trachéal. Et fixez le tube en place avec les ligatures pré-préparées. Pour disséquer les nerfs des membres postérieurs, utilisez une lame numéro 21 pour faire une coupure longitudinale sur le côté postérieur du membre postérieur du membre arrière gauche, du tendon d’Achille à la hanche.
Et utilisez des ciseaux pour faire une coupe entre les régions antérieures et postérieures de la fossa popliteal, à l’arrière de l’articulation du genou. Couper deux têtes du biceps femoris, pour exposer le nerf sciatique. Et séparer la tête latérale de la tête médiale du muscle gastrocnemius, pour exposer le nerf tibial et ses branches.
Ensuite, utilisez le nombre 55 forceps, pour disséquer soigneusement le gastrocnemius médial et le gastrocnemius latéral et les nerfs soleus. Les déconnecter des tissus environnants tout en maintenant leur connexion avec les muscles respectifs. Pour effectuer la laminectomie, utilisez une lame numéro 21 pour faire une incision longitudinale du sacrum jusqu’aux vertèbres thoraciques.
Et identifier la vertèbre Th13, comme un segment thoracique le plus bas avec une insertion de nervures. Ensuite, utilisez des rongeurs fins pour enlever les processus épineux et laminae du Th13 aux vertèbres L2, pour exposer les segments lombaires de la moelle épinière. Pour fixer la colonne vertébrale, placez le rat dans un cadre sur mesure sur un coussin chauffant de 37 degrés Celsius, relié à un système de chauffage en boucle fermée.
Et utilisez les volets cutané pour former une piscine profonde au-dessus de la moelle épinière exposée. Placez les pinces métalliques sous les procédés transversaux Th12 et les procédés épineux L3 et remplissez la piscine d’huile minérale de 37 degrés Celsius. Utilisez les volets cutanés pour faire une piscine profonde d’huile minérale sur les nerfs tibial, médials et gastrocnemius latéral et soleus.
Et placez les nerfs sur le fil d’argent bipolaire stimulant les électrodes. Connectez ensuite les électrodes à un stimulateur d’impulsion carrée à l’aide de canaux de stimulation distincts pour chaque nerf. Pour un placement d’électrode de surface, sous le microscope disséquant, placez une électrode de boule d’argent sur le côté caudal gauche de la moelle épinière exposée.
Avec une électrode de référence insérée dans les muscles du dos. Et connectez les deux électrodes à l’amplificateur différentiel DC. Utilisez un stimulateur à courant constant pour stimuler le gastrocnemius médial et les nerfs gastrocnemius et soleus latériaux, avec des impulsions carrées d’une durée de 0,1 milliseconde répétées à une fréquence de trois hertz et observez les volées afferentes.
À la fin de la simulation, déplacez l’électrode de surface de façon rostrale et répétez la stimulation pour identifier les segments rachidiens auxquels les amplitudes des volées sont les plus élevées pour chaque nerf. Après avoir déterminé l’emplacement de la volée maximale, livrer un bloqueur neuromusculaire par voie intraveineuse pour paralyser le rat. Tandis qu’un assistant relie le tube trachéal à un ventilateur externe en ligne avec un nominateur compatible de chapeau de rongeur.
Pour ouvrir le dura et le pia mater, utilisez le nombre 55 forceps pour soulever doucement le dura mater, et coupez le tissu caudally du segment L5, rostrally jusqu’au segment L4. Ensuite, utilisez une paire de forceps 5SF ultra minces, pour faire une petite tache dans le pia, couvrant la colonne dorsale entre les vaisseaux sanguins. Exactement au niveau de la volée maximale afferent de la gastrocnemius médiale et gastrocnemius latéral et nerf soleus.
Pour placer les électrodes de stimulation à courant direct trans-spinal, placez une éponge saline trempée sur le côté dorsale des vertèbres Th12. Et utilisez la manipulation fine pour appuyer sur l’éponge avec une électrode active de stimulation de courant direct trans-spinal. Montez ensuite une microélecrode mise en commun personnalisée, sur le micro manipulateur, permettant un mouvement de pas d’un à deux microns et un étalonnage stéréotaxique.
Et conduire une pointe de micropipette dans un patch sélectionné dans le pia, à un angle latéral médial de 15 à 20 degrés. Pour enregistrer la membrane motoneurone et les propriétés de cuisson, en mode pont de l’amplificateur intracellulaire, stimuler les branches nerveuses respectives pour identifier le motoneuron sur la base de l’apparence tout ou rien, du potentiel d’action antidromique. Dans le mode de pince actuelle discontinue de l’amplificateur intracellulaire avec un mode de vitesse de commutation actuel de quatre à huit kilohertz, utilisez un courant dépolarisant intracellulaire de 0,5 milliseconde, pour évoquer un potentiel d’action orthodontique, dans le motoneuron.
Pour calculer la résistance à l’entrée cellulaire, stimulez un motoneuron, avec 40 courtes impulsions de 100 millisecondes de courant hyperpolarisant d’un nanogramme. Pour déterminer la valeur de base réelle comme amplitude minimale du courant dépolarisant nécessaire pour obtenir un seul pic, stimulez un motoneuron avec des impulsions d’ondes carrées de 50 millisecondes à des amplitudes croissantes. Injectez ensuite des impulsions d’ondes carrées de 500 millisecondes de courant dépolarisant, à des amplitudes croissantes.
En 0,1 à deux étapes d’ampli nano, pour évoquer les décharges rythmiques des motoneurones. Pour une stimulation trans-spinale de courant direct, commencez les procédures de polarisation par application trans-spinale du courant direct, tout en maintenant une pénétration stable du motoneuron. Ici, un potentiel typique d’action orthotrope, évoqué par la stimulation intracellulaire qui répond à tous les critères d’inclusion des données est montré.
Dans cette analyse, une réponse cellulaire à une impulsion actuelle hyperpolarisante de 100 millisecondes d’un nanogramme. À partir de laquelle la résistance d’entrée de crête et de plateau d’un motoneuron, peut être déterminée à partir de la déviation de tension, peut être observée. Cette trace de tension élargie d’un pic de base réel, présente un seuil de tension clairement marqué de la pointe.
Indiquant le niveau de dépolarisation membranaire auquel les canaux de sodium fermés par tension sont activés pour initier le potentiel d’action. Ces graphiques fournissent des exemples de traces de tension intracellulaire. De deux motoneurones, stimulés intracellulairement avec des impulsions carrées de 500 millisecondes de courant dépolarisant.
Avant, pendant et après une application de stimulation trans-spinale à courant direct. La stimulation directe trans-spinale anodale de courant s’est trouvée pour agir vers une excitabilité accrue de motoneuron et des fréquences plus élevées de tir rythmique. Tandis que la stimulation directe trans-spinale cathodale de courant, a agi à l’inhibition de tir.
En outre, les effets des deux types de stimulation trans-spinale de courant direct, ont survécu à la période de polarisation. Des données inexactes peuvent être acquises, si les critères d’inclusion des données sont compromis en raison de la pénétration imparfaite des cellules. Un défaut de compenser la résistance et la capacitance des microélecrodations ou une instabilité de la moelle épinière.
Il est impératif qu’aucun dommage n’est fait à la moelle épinière pendant la dissection car les dommages peuvent avoir comme conséquence le choc spinal, rendant d’autres enregistrements impossibles. Il est possible de prélever des échantillons de tissus pour une analyse chimique histologique ou immunométologique. Par exemple, la mesure de l’expression c-fos peut être utilisée comme un proxy de l’activité neuronale.
