L’intérêt pour la microscopie électronique liquide a explosé ces dernières années, car nous pouvons maintenant visualiser les processus en temps réel à l’échelle nanométrique. L’amélioration des connaissances sur ces structures flexibles peut nous aider à développer de nouveaux réactifs pour lutter contre les agents pathogènes émergents tels que le SRAS-CoV-2. Observer les protéines dans un environnement fluide aide à imiter les systèmes biologiques et nous donne l’occasion d’examiner les protéines de manière plus dynamique.
Et cette expérience vous montrera de nouvelles techniques sur la façon d’utiliser et de visualiser les protéines dans les environnements vitreux et liquides. Les résultats récents incluent des informations dynamiques sur les candidats vaccins dans les thérapies à base d’anticorps imagées dans un liquide. Les applications liquides corrélatives et cryo-EM font progresser notre capacité à visualiser la dynamique moléculaire, fournissant un contexte unique pour la santé humaine et la maladie.
Les lecteurs utilisant des technologies conventionnelles de GDT ou de cryo-EM peuvent envisager de mettre en œuvre des flux de travail EM liquides pour fournir de nouvelles observations dynamiques de leurs échantillons d’une manière qui complète leurs stratégies actuelles. Les systèmes EM liquides disponibles dans le commerce peuvent fournir un débit, un mélange, des stimuli électrochimiques et un contrôle de la température, qui sont essentiels pour de nombreuses applications d’imagerie en temps réel. La méthode sandwich par micropuce présentée ici décrit un moyen simple d’entrer de gamme pour d’abord visualiser des échantillons dans un liquide avant de passer à un système commercial plus complexe pour les expériences in situ.
Pour commencer, nettoyez les micropuces de nitrure de silicium en incubant chaque puce dans 150 millilitres d’acétone pendant deux minutes, suivie d’une incubation dans 150 millilitres de méthanol pendant deux minutes. Laissez les copeaux sécher dans un flux d’air laminaire. Nettoyez au plasma les copeaux séchés à l’aide d’un instrument à décharge luminescente fonctionnant dans des conditions standard pendant 45 secondes à l’aide de gaz argon.
Ensuite, chargez une micropuce de base sèche dans l’extrémité du porte-échantillon et ajoutez environ 0,2 microlitre de l’échantillon à la puce de base. Après avoir incubé pendant une à deux minutes, placer la puce supérieure sur la puce de base humide contenant l’échantillon. Plantez l’ensemble ensemble pour former une enceinte hermétiquement scellée maintenue mécaniquement en place par trois vis en laiton.
Pompez la pointe à 10 à moins six torr à l’aide d’une station de pompage à sec turbo. Le support est maintenant prêt à être inséré dans le TEM. Nettoyez au plasma les micropuces et les grilles de carbone à l’aide d’un instrument de décharge luminescente pendant 45 secondes.
Et ajoutez environ deux microlitres d’échantillon à une micropuce déchargée par lueur placée sur un pack de gel. Retirer l’excès de solution à l’aide de papier filtre ou d’une pipette et incuber pendant une à deux minutes. Ajoutez ensuite la grille de carbone à décharge luminescente à la micropuce humide contenant l’échantillon.
Plantez l’ensemble à l’aide d’un seul porte-échantillon inclinable à température ambiante pour former une enceinte hermétiquement scellée. Vous pouvez également utiliser des clips de grille de chargement automatique et placer l’ensemble sandwich sur le clip C inférieur. Placez le clip supérieur sur l’ensemble et utilisez l’outil de serrage standard pour sceller l’ensemble.
Le spécimen est maintenant prêt à être inséré dans le TEM. Examiner les échantillons placés dans des chargeurs automatiques dans des conditions cryogéniques ou à température ambiante. Pour l’imagerie EM liquide, chargez le porte-échantillon dans le TEM équipé d’un canon à émission de champ et faites fonctionner à 200 kilovolts.
Allumez le pistolet et ajustez la hauteur eucentrique de l’étage du microscope par rapport à l’échantillon en utilisant la fonction oscillante, en inclinant l’échantillon de moins 15 degrés à plus 15 degrés dans la colonne. Cette procédure ajuste la platine dans la direction Z pour s’adapter à l’épaisseur de l’échantillon et permet d’assurer un grossissement précis pendant l’enregistrement de l’image. Enregistrez des images sous forme de films à cadre long ou d’images individuelles à l’aide du progiciel de collecte de données série, en mettant en œuvre des routines d’imagerie automatisées.
Obtenez des images dans des conditions à faible dose à des grossissements allant de 28 000X à 92 000X et 40 images par seconde. Ajustez les temps d’exposition pour minimiser les dommages causés par le faisceau à l’échantillon et utilisez une plage de défocalisation de moins un à quatre micromètres au grossissement spécifié. Si une solution épaisse est rencontrée, utilisez des valeurs de défocalisation plus élevées ou sélectionnez une autre région d’intérêt.
Assurez-vous que la solution est présente dans les échantillons tout au long de la séance d’imagerie en concentrant le faisceau d’électrons sur une zone sacrificielle non utilisée pour la collecte de données jusqu’à ce que des bulles soient formées. Analysez les films pour les particules SARS-CoV-2 à l’aide du programme RELION-3.0.8 ou de tout autre logiciel de traitement d’image. Effectuez une correction de mouvement à l’aide du programme MotionCor2.
Une fois corrigées, extraire les particules à l’aide de l’outil de prélèvement automatique dans le progiciel du programme. Les tailles de boîte typiques sont de 330 pixels pour les spécimens liquides et de 350 pixels pour les spécimens de glace. Calculez les reconstructions initiales à l’aide de la symétrie C1 avec la routine du modèle initial 3D du programme et les options de modèle ab initio dans le progiciel de traitement des données.
Ensuite, exécutez des protocoles d’affinement dans le logiciel de traitement des données. Examinez les résultats à l’aide d’un logiciel d’analyse de structure moléculaire tout en évaluant les changements dynamiques. Une comparaison des structures liquide-EM et cryo-EM dans le sous-type trois du virus adéno-associé ou AAV est présentée ici.
Les images représentatives montrent la structure de l’AAV dans la solution et dans la glace. Les vues de rotation de la sous-unité AAV VP1 extraites des structures liquide et glacée sont montrées ici. Ces images représentent les valeurs dynamiques dans les structures liquides générées à l’aide de la fonction morph map du logiciel d’analyse de structure moléculaire.
Les structures moyennes de plusieurs assemblages de virus montrent des changements conformationnels avec un changement de diamètre de près de 5% mesuré à l’aide de données EM. Une image des assemblages sous-viraux du SRAS-CoV-2 isolés à partir de fractions sériques de patients atteints de COVID-19 est montrée ici. Ces bulles blanches indiquent la présence de liquide dans l’échantillon.
Une reconstruction EM de ces assemblages sous-viraux est montrée ici avec des densités radiales colorées à cinq tranches nanométriques à travers la carte. L’image représentative décrit l’analyse de particules à double couche de rotavirus préparées dans de la glace vitrée à l’aide de la technique sandwich à micropuce. L’utilisation de détergents, de glycérol, de polyéthylène, de glycols et de niveaux élevés de sucres doit être minimisée ou évitée pour l’imagerie EM liquide.
Ces réactifs peuvent introduire des artefacts, créer des bulles excessives, des produits d’hydrolyse et des radicaux libres en raison des dommages causés par le faisceau. L’utilisation de ces protocoles permettra aux scientifiques d’être en mesure d’étudier les processus dynamiques au détail atomique. Et cela couvre de multiples domaines scientifiques, notamment la médecine, les sciences de la vie et la recherche sur les matériaux.
Les protocoles présentés ici décrivent comment des outils de pointe peuvent fournir un moyen passionnant de visualiser les macromolécules biologiques à travers de nouveaux yeux. Le domaine de la microscopie électronique liquide pourrait améliorer la façon dont nous étudions ces nouveaux virus qui constituent une menace pour la santé humaine, peut-être même contribuer à nos mesures de préparation aux pandémies.
