Les auteurs tiennent à remercier le Dr Zhao et Gongpu Danxia Ke pour le soutien technique. Nous remercions les Drs. Edward Egelman et Niko Grigorieff pour partager leur logiciel de traitement d&#39;image. Nous reconnaissons également le personnel qui soutiennent la biologie structurale cryo-EM installations et cluster Beowulf et la grille à l&#39;Université de Pittsburgh de la médecine. Ce travail a été soutenu par GM082251 et GM085043.

1. Frozen-hydraté préparation des échantillons EM Parce que le VIH-1 protéine de capside (CA) sont stables assemblées 9 seulement en sel (NaCl 1M) tampon, ce qui contribue le bruit de fond fort dans la cryo-EM images, nous utilisons une dilution rapide et retour côte méthode de buvard pour transitoirement réduire le sel la concentration lors de la préparation de la grille congelés-hydratés EM. <ol><li> Décharge luminescente côté de carbone de 200 mailles R2 / 1 des grilles de cuivre Quantifoil sous 25mA pendant 25 secondes. </li><li> Utilisez un nébuliseur pour amener le taux d&#39;humidité dans la chambre de l&#39;environnement, un home-made plongeur gravité manuel, à 80%. </li><li> Dans le dewar FEI Vitrobot piston, cool éthane liquide en utilisant l&#39;azote liquide. Montez le dewar plongent au point de congélation sur le plongeur gravité manuel. </li><li> Appliquer 2,5 ul de la solution CA prémonté sur le côté de la grille de carbone, qui est monté sur une pince, et de la charge de la pince sur le piston avec le côté de carbone de la grille face à vous. </li><li> Ajouter 3 pi de tampon de sel faible dilution (100 mM NaCl) à l&#39;arrière de la grille et immédiatement éponger la face arrière de la grille avec un morceau de papier filtre. La surface arrière ensemble de la grille doit être en contact étroit avec le papier filtre pendant environ 6 secondes, avant de retirer le papier filtre. Plonger immédiatement dans la grille de l&#39;éthane liquide après avoir retiré le papier filtre. </li><li> Retirer les pinces du piston et de transférer rapidement de la grille dans une boîte de stockage réseau. </li></ol> 2. Cryo-microscopie électronique de CA assemblages tubulaires <ol><li> Chargez la grille congelés-hydraté dans une exploitation FEI Polara G2 microscope électronique à 200kV et équipé d&#39;une caméra CCD Gatan 4Kx4K. </li><li> Dans le mode à faible dose à la recherche, à un grossissement de 200x ~ et avec une dose &lt;0.001e - / A 2, l&#39;écran toute la grille pour les zones de glace convenable et enregistrer les positions de ces domaines dans un fichier de scène. </li><li> Rappel des positions enregistrées et l&#39;écran davantage ces domaines à un grossissement de x 3900 en mode de faible dose de recherche. Sélectionnez les zones avec un uniforme, mince couche de glace contenant bien séparées, de longs tubes sur les trous, pour la collecte des données. Enregistrer les emplacements de ces zones dans un fichier de la deuxième étape. </li><li> Passer en mode d&#39;exposition à un grossissement de 59 000 x 100 en médaillon une ouverture de l&#39;objectif um, et ajuster la stigmatisation objectif et l&#39;intensité du faisceau pour une dose de ~ 15 e - / A 2 par l&#39;exposition. </li><li> Retour au mode de faibles doses de recherche, passer à une position enregistrée et d&#39;identifier et d&#39;un centre à l&#39;aide d&#39;un tube de bons de la caméra CCD. Passez en mode mise au point, d&#39;ajuster le focus, et définir une valeur défocalisation, normalement entre 0,5 à 2,5 um. Basculer vers le mode d&#39;exposition, mis un temps d&#39;exposition de 0,3-0,5 secondes, pour une dose de 15 e - / A 2, et de recueillir une image. Les images sont recueillies sur un appareil à plaques, et les films devraient être autorisés à s&#39;installer pendant 10 secondes avant une exposition est prise. </li><li> Déplacement à la position suivante sauvés et répétez l&#39;étape 5 pour recueillir plus d&#39;images. </li><li> Les films sont développés en pleine force D19 pendant 12 minutes et numérisées en utilisant un Nikon Super Coolscan 9000 ED Scanner à une taille de pixel de 6,35 um. Le format des fichiers d&#39;image est TIFF. </li></ol> 3. Indexation hélicoïdal Un objet hélicoïdale peut être indexé par deux paramètres: l&#39;ordre de Bessel, n, et le numéro de ligne de la couche, L. Chaque ligne du calque dans la transformée de Fourier, qui se caractérise par (n, l), correspond à un ensemble de lignes sur le réseau de surface de l&#39;objet dénoté par hélicoïdale (h, k) des indices, en utilisant la notation d&#39;un treillis 2D. Pour tout (h, k), une ligne de couche (n hk, l hk) est une combinaison linéaire de deux vecteurs de base (n 10, L 10) et (n 01, L 01), qui sont les valeurs de n et l les deux lignes principales couches (1, 0) et (0, 1). L peut être obtenu à partir de la hauteur de ligne couche mesurée selon l&#39;axe Z dans la transformée de Fourier. La valeur de n peut être estimée en utilisant l&#39;équation suivante 10 πRr ≈ J n ≈ 1,1 | n | -0,9 .....................( 1) où J n est la fonction de Bessel, qui détermine l&#39;intensité de la ligne n ème couche, r est le rayon de l&#39;objet hélicoïdale, et R est le rayon de l&#39;amplitude maximale de la ligne de couche. Le numéro de ligne couche, l, est lié à n par la règle 11 sélection l = tn + euh ....................( 2) où t et u sont des constantes de l&#39;hélice. Pour toute hélice donné, il peut y avoir des unités exactement u exactement (ou très près) t cOMPLÈTE tours. <ol><li> Boîte à un tube relativement droit et long avec un diamètre uniforme en utilisant le programme du RESE 12 helixboxer et enregistrer l&#39;image au format de la MRC. </li><li> Déterminer la distance de répétition hélicoïdale, c, en utilisant un programme de corrélation croisée basée, comme «imgccf», dans le paquet MRC 13. </li><li> Calculer la transformée de Fourier avec une longueur de nouvelle boîte qui est une intégrale de la distance de répétition, c. </li><li> Choisissez deux lignes principales couche de base qui définissent deux vecteurs en treillis de surface (1,0) et (0,1). </li><li> Mesurer le rayon du tube, r, et la hauteur et le rayon des deux lignes de la couche principale de la transformée de Fourier, L 10, R 10, R 01 L 01, respectivement (Fig. 1). </li><li> Calculer N 10 et N 01 selon l&#39;équation (1). </li><li> Depuis n valeurs ne sont que l&#39;estimation, quelques combinaisons de N 10 et N 01 sont testés dans les étapes ultérieures (voir l&#39;étape 4.2) afin de trouver la symétrie hélicoïdale correcte en utilisant l&#39;emballage IHRSR programme. </li><li> Calculer la symétrie vis décrite par deux nombres réels: la rotation entre les sous-unités (Δφ) et la montée axiale (Az) de l&#39;hélice une étoile (n = 1). Compte tenu de l 10, L 01, n 10, 01 et n valeurs, u et t peuvent être obtenus en testant une série de valeurs m (par exemple, -50 &lt;m &lt;50) selon la règle de sélection. Enfin, Δφ et Az sont calculées en utilisant Δφ = 360 t / u et Az = c / u. </li></ol> 4. Reconstruction tridimensionnelle <ol><li> La segmentation des particules <ol><li> Ouvrez une micrographie contenant des particules hélicoïdales, en utilisant le Boxer programme graphique, qui est un programme dans le paquet du RESE. </li><li> Couper la particule hélicoïdale en segments qui se chevauchent. Dans le panneau de contrôle de Boxer, choisissez le mode Helix et définir les paramètres pour la boxe: la taille de la boîte doit être plus grand que le diamètre de la particule et la valeur pour &#39;Olap &quot;doit être ~ 90% de la taille de la boîte. </li><li> Après un clic gauche sur chaque extrémité de la particule hélicoïdale, Boxer va générer automatiquement une série de boîtes de particules le long d&#39;hélice. </li><li> Enregistrer les segments encadrés ainsi que leurs coordonnées. </li></ol></li><li> Initial de reconstruction 3D en utilisant des programmes IHRSR <ol><li> Inverser le contraste des images cryo-EM et appliquer filtrage passe-bas 14 (en option) avant de traiter avec la méthode itérative de reconstruction hélicoïdale espace réel (IHRSR). </li><li> Ouvrez l&#39;interface graphique du programme IHRSR en tapant «générateur». Fournir de l&#39;interface graphique avec toutes les informations pour la pile en boîte particules, y compris le nom et le chemin de la pile, le nombre d&#39;images dans la pile, les valeurs pour les paramètres de la symétrie, etc Cliquez sur le bouton «Finish» pour créer le script de reconstruction, b25.spi. </li><li> Utiliser un cylindre plein ou creux comme une référence initiale et permettre à la procédure au cycle jusqu&#39;à ce qu&#39;il n&#39;y a aucun changement dans la symétrie vis définis, qui survient généralement après quelques cycles. Une symétrie droite hélicoïdale doit donner une reconstruction stable convergé. La reconstruction généré lors du dernier cycle sera utilisée comme une référence initiale pour affiner davantage. IHRSR effectue la reconstruction 3D en utilisant des programmes SPIDER. </li></ol></li><li> Reconstruction avec raffinement itératif 15 La reconstruction 3D générés par IHRSR est maintenant utilisée comme une référence initiale de raffinement supplémentaire. Pendant le raffinement, la symétrie hélicoïdale est fixée à Δφ et Az, qui sont déterminés à partir de la procédure IHRSR. <ol><li> Déterminer la défocalisation et de présenter l&#39;astigmatisme sur la micrographie et de l&#39;utilisation de programmes CTFFIND3 CTFTILT 16. </li><li> Multipliez les segments de particules par le FCT en utilisant des programmes SPIDER 17. L&#39;opération dite FT dans la suite de SPIDER est utilisée pour calculer la transformée de Fourier (FFT) de l&#39;image 2D. Par la suite, la FFT est multiplié par les valeurs du FCT, déterminée dans les étapes précédentes, en utilisant l&#39;opération appelée MU dans la suite SPIDER. La valeur obtenue est ensuite transformée inverse arrière pour former une nouvelle image (CTF-corrigé) dans l&#39;espace réel en utilisant l&#39;opération SPIDER, FT nouveau. </li><li> Effectuer correspondant de projection en comparant les prévisions des volumes de référence avec le FCT-corrigées des images, en utilisant l&#39;alignement de référence multi-. La variation de l&#39;angle d&#39;inclinaison out-of-avion est limité à + / -10 ° et échantillonnés dans les étapes 1 °. Introduire des contraintes, telles que les coefficients de corrélation élevés, dans le plan angles proche de 0 ° ou 180 ° et limités x-quarts, pour les paramètres d&#39;alignement de chaque segment. Inclure dans la reconstruction uniquement les segments qui satisfont les contraintes. </li><li> Après chaque cycle itératif de raffinement, une reconstruction 3D est généré en utilisant la projection arrière et divisée par la somme sur le CTF2. </li><li> Imposer la symétrie hélicoïdale de générer un volume symétrisée. Le raffinement itératif est terminé lorsque aucune amélioration dans la résolution de la reconstruction 3D nouvelle survient. </li><li> Le SPIDER forfait de traitement d&#39;image est utilisé pour la plupart des étapes de raffinement. Une série d&#39;opérations sont contrôlées par des scripts SPIDER, qui sont créés par l&#39;utilisateur des fichiers de contrôle des lots contenant des séquences d&#39;opérations et les valeurs des paramètres. La reconstruction finale est calculée en utilisant des programmes dans SPIDER suite. </li></ol></li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Un seul VIH-1 CA A92E tube (Fig. 1a) était hors boîte et sa transformée de Fourier (Fig. 1b) a été calculée pour l&#39;indexation hélicoïdale. Pour les lignes de la couche (1, 0) et (0, 1), L 10 = 28, L 01 ​​= 37, R 10 = 55, R 01 = 44. Etant donné un rayon de tube de 211.57Å, nous approchée n 10 =- 12, n 01 = 11 (ici, l&#39;impartialité a été prédéterminée). Avec une distance de répétition de 5195.48Å, la symétrie à vis du tube a été déterminée comme Az = 6.8093Å, Δφ = 328,88 °. Az et Δφ ont été raffinés pour 7.1321Å et 328,86 ° en utilisant IHRSR (fig. 2a) et la reconstruction initiale est montré dans la Fig. 2b. La reconstruction finale (fig. 3), après affinage itératif, l&#39;amélioration de la carte de densité de façon significative à partir du modèle initial calculé par IHRSR (fig. 2b). <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Indexation du VIH-1 CA hélicoïdaux tube. (A) Une seule image de VIH-1 tube de CA A92E. La barre d&#39;échelle, de 30 nm. (B) La transformée de Fourier du tube représenté en (A). Les indices hélicoïdale (n 10 =- 12, n 01 = 11) sont notés. La flèche pointe vers la ligne à la résolution de la couche 23a. <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Une reconstruction initiale à l&#39;aide IHRSR. (A) la détermination de symétrie vis pour chaque cycle itératif. Δφ et Az, à partir des valeurs initiales, convergent vers des valeurs stables après 10 cycles itératifs de raffinement. (B) La carte 3D densité initiale au bout de 10 cycles itératifs. <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. La carte de densité 3D après le raffinement itératif. (AC) La carte de densité des tubes CA est affiché comme trois tranches orthogonales: parallèlement à l&#39;axe du tube et proche de la surface (A), perpendiculaire à l&#39;axe du tube (B), et parallèlement à et à travers l&#39;axe du tube (C) . Barres d&#39;échelle, de 10 nm. (D) le rendu de surface de la carte de densité 3D profilée à 1,8 s enfermer un volume de 100%.

<ol>
	<li>Frank, J., Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+single+particles+negatively+stained+or+in+vitreous+ice.">Three-dimensional reconstruction of single particles negatively stained or in vitreous ice.</a> Ultramicroscopy. 46, 241-262 (1992).</li><li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+Purple+Membrane+from+Halobacterium-Halobium+-+Analysis+of+X-Ray-Diffraction+Pattern.">Structure of Purple Membrane from Halobacterium-Halobium - Analysis of X-Ray-Diffraction Pattern.</a> J Mol Biol. 93, 123-128 (1975).</li><li>Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+iterative+helical+real+space+reconstruction+method:+surmounting+the+problems+posed+by+real+polymers.">The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers.</a> J Struct Biol. 157, 83-94 (2007).</li><li>Egelman, E. H., Francis, N., Derosier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F-Actin+Is+a+Helix+with+a+Random+Variable+Twist.">F-Actin Is a Helix with a Random Variable Twist.</a> Nature. 298, 131-135 (1982).</li><li>Nogales, E., Whittaker, M., Milligan, R. A., Downing, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+model+of+the+microtubule.">High-resolution model of the microtubule.</a> Cell. 96, 79-88 (1999).</li><li>Jimenez, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+structure+of+an+SH3+amyloid+fibril+and+model+of+the+molecular+packing.">Cryo-electron microscopy structure of an SH3 amyloid fibril and model of the molecular packing.</a> Embo J. 18, 815-821 (1999).</li><li>Butler, P. J., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+particle+of+tobacco+mosaic+virus+from+RNA+and+disks+of+protein.">Assembly of the particle of tobacco mosaic virus from RNA and disks of protein.</a> Nat New Biol. 229, 47-50 (1971).</li><li>Namba, K., Yamashita, I., Vonderviszt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+core+and+central+channel+of+bacterial+flagella.">Structure of the core and central channel of bacterial flagella.</a> Nature. 342, 648-654 (1989).</li><li>Byeon, I. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Convergence+between+Cryo-EM+and+NMR+Reveals+Intersubunit+Interactions+Critical+for+HIV-1+Capsid+Function.">Structural Convergence between Cryo-EM and NMR Reveals Intersubunit Interactions Critical for HIV-1 Capsid Function.</a> Cell. 139, 780-790 (2009).</li><li>Toyoshima, C., Unwin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+the+acetylcholine+receptor+by+cryoelectron+microscopy+and+helical+image+reconstruction.">Three-dimensional structure of the acetylcholine receptor by cryoelectron microscopy and helical image reconstruction.</a> J Cell Biol. 111, 2623-2635 (1990).</li><li>Toyoshima, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+determination+of+tubular+crystals+of+membrane+proteins.+I.+Indexing+of+diffraction+patterns.">Structure determination of tubular crystals of membrane proteins. I. Indexing of diffraction patterns.</a> Ultramicroscopy. 84, 1-14 (2000).</li><li>Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN:+semiautomated+software+for+high-resolution+single-particle+reconstructions.">EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions.</a> J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).</li><li>Yonekura, K., Toyoshima, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+determination+of+tubular+crystals+of+membrane+proteins.+IV.+Distortion+correction+and+its+combined+application+with+real-space+averaging+and+solvent+flattening.">Structure determination of tubular crystals of membrane proteins. IV. Distortion correction and its combined application with real-space averaging and solvent flattening.</a> Ultramicroscopy. 107, 1141-1158 (2007).</li><li>van Heel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+electron+cryo-microscopy:+towards+atomic+resolution.">Single-particle electron cryo-microscopy: towards atomic resolution.</a> Q Rev Biophys. 33, 307-369 (2000).</li><li>Sachse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+electron+microscopy+of+helical+specimens:+A+fresh+look+at+Tobacco+Mosaic+Virus.">High-resolution electron microscopy of helical specimens: A fresh look at Tobacco Mosaic Virus.</a> J Mol Biol. 371, 812-835 (2007).</li><li>Mindell, J. A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+determination+of+local+defocus+and+specimen+tilt+in+electron+microscopy.">Accurate determination of local defocus and specimen tilt in electron microscopy.</a> J Struct Biol. 142, 334-347 (2003).</li><li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+and+WEB:+Processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields.">SPIDER and WEB: Processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).</li><li>Zhang, P. J., Hinshaw, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+dynamin+in+the+constricted+state.">Three-dimensional reconstruction of dynamin in the constricted state.</a> Nat Cell Biol. 3, 922-926 (2001).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Nous présentons un ensemble de protocoles pour fournir une approche simple pour obtenir des structures 3D d&#39;objets en hélice. En utilisant les procédures décrites, nous avons acquis une structure 3D du VIH-1 assemblage de la capside partir d&#39;une image simple tube (176 segments). Structures à plus haute résolution peut être obtenue en incluant des données d&#39;image de plus. Il ya plusieurs points critiques pour la collecte des données optimale et d&#39;analyse: d&#39;abord, lors de la préparation d&#39;un échantillon de cryo-EM, la solution de l&#39;échantillon doit être effacé, laissant un uniforme, fine couche de solution qui est légèrement plus épais que la taille de l&#39;échantillon. Il ya plusieurs façons différentes d&#39;effacer l&#39;échantillon. Pour les cellules bactériennes et de spécimens tubulaires, telles que le VIH-1 de l&#39;Assemblée CA, effaçant d&#39;un côté, en particulier de l&#39;arrière-côte, est la plus appropriée. Deuxièmement, l&#39;impartialité de l&#39;hélice doit être déterminée, car cela ne peut se faire par l&#39;indexation hélicoïdale ou de reconstruction. Une pratique courante est d&#39;utiliser le gel gravure, suivie par l&#39;observation rotative 18 pour déterminer impartialité. Impartialité peut également être déterminée d&#39;après-reconstruction quand la résolution de la carte de la densité est suffisamment élevée; les modèles 3D atomiques des composants individuels devraient s&#39;intègrent bien dans la carte de la densité quand un autoritarisme est supposée correcte. Sinon, l&#39;impartialité inverse devrait être assumée. Troisièmement, un filtre de Wiener doit être utilisé pendant le traitement d&#39;image, pour les deux phases et de correction d&#39;amplitude, de réduire l&#39;amplification du bruit. Depuis le FCT à partir d&#39;une seule image a toujours des passages par zéro, une partie de l&#39;information dans l&#39;espace réciproque est perdu. Par conséquent, il est nécessaire de disposer de données de projection de multiples jeux inclus pour la reconstruction 3D, chaque imagées à des valeurs différentes défocalisation.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Source </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Décharge luminescente dispositif de 100X </td><td> Décharge luminescente dispositif de 100X </td><td></td></tr><tr><td> Tecnai Polara F30 microscope avec un canon à émission de champ </td><td> FEI, Hillsboro, OR </td><td></td></tr><tr><td> Gatan 4k x 4k caméra CCD </td><td> Gatan, Pleasanton, CA </td><td></td></tr><tr><td> Plongez-gel dispositif de </td><td></td><td> Home-made plongeur gravité manuelle </td></tr><tr><td> Quantifoil R2 / 1 200 grilles treillis de cuivre holely carbone </td><td> Quantifoil Micro Outils, Jena, Allemagne </td><td></td></tr><tr><td> EM logiciels RESE </td><td> <a href="http://blake.bcm.edu/EMAN/">http://blake.bcm.edu/EMAN/</a> </td><td></td></tr><tr><td> EM logiciels IHRSR </td><td> <a href="http://people.virginia.edu/~ehe2n/">http://people.virginia.edu/ ~ ehe2n /</a> </td><td> Programmes disponibles à partir de Edward H. Egelman </td></tr><tr><td> EM logiciels araignée </td><td> <a href="http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html">http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</a> </td><td></td></tr><tr><td> MRC base des logiciels de traitement hélicoïdale </td><td> <a href="http://www.riken.jp/biostrmech/index.html">http://www.riken.jp/biostrmech/index.html</a> </td><td> Programmes disponibles à partir de Koji Yonekura </td></tr><tr><td> CTFFIND3/CTFTILT et l&#39;espace réel du logiciel de raffinement hélicoïdale </td><td> <a href="http://emlab.rose2.brandeis.edu/software">http://emlab.rose2.brandeis.edu/software</a> </td><td></td></tr></tbody></table>

structure of hiv-1 capsid assemblies by cryo-electron microscopy and iterative helical real-space reconstruction

Cryo-microscopie électronique (cryo-EM), combiné avec le traitement d&#39;image, est un outil puissant pour la détermination de la structure des complexes de protéines et des assemblages macromoléculaires. En fait, seule la microscopie électronique de particules 1 et à deux dimensions (2D) cristallographie électronique 2 sont devenus des méthodologies relativement courantes et un grand nombre de structures ont été résolus en utilisant ces méthodes. Dans le même temps, le traitement d&#39;image et en trois dimensions (3D) la reconstruction d&#39;objets hélicoïdale s&#39;est rapidement développée, en particulier, l&#39;itératif hélicoïdale espace réel de reconstruction (IHRSR) la méthode 3, qui utilise des outils simples d&#39;analyse des particules en conjonction avec une symétrie hélicoïdale. De nombreuses entités biologiques fonction dans les formes filamenteuses ou hélicoïdale, dont les filaments d&#39;actine 4, 5 microtubules, fibres amyloïdes 6, 7 virus mosaïque du tabac, et les flagelles des bactéries 8, et, parce que une carte de densité d&#39;une entité 3D hélicoïdale peut être atteint par une seule projection l&#39;image, par rapport aux images de nombreux nécessaires pour la reconstruction 3D d&#39;un objet non hélicoïdales, avec la méthode IHRSR, analyse structurale de ces assemblages flexibles et désordonnés hélicoïdale est maintenant réalisable. Dans cet article, vidéo, nous fournissons des protocoles détaillés pour l&#39;obtention d&#39;une carte de densité 3D d&#39;un assemblage de protéines hélicoïdales (VIH-1 capside 9 est notre exemple), y compris des protocoles pour la préparation des échantillons cryo-EM, faible dose de collecte de données par cryo-EM, l&#39;indexation des figures de diffraction hélicoïdale et le traitement d&#39;image et de la reconstruction 3D utilisant IHRSR. Comparé à d&#39;autres techniques, la cryo-EM offre conservation des spécimens optimale dans des conditions proches des conditions natives. Les échantillons sont noyées dans une couche mince de glace vitreuse, par congélation rapide, et imagée dans les microscopes électroniques à la température de l&#39;azote liquide, dans des conditions à faible dose pour minimiser les dégâts d&#39;irradiation. Exemples d&#39;images sont obtenues dans des conditions quasi native aux dépens des signaux faibles et faible contraste dans les micrographies enregistrées. Heureusement, le processus de reconstruction hélicoïdale a été largement automatisée, à l&#39;exception de l&#39;indexation du spectre de diffraction hélicoïdale. Ici, nous décrivons une approche à l&#39;index structure hélicoïdale et de déterminer les symétries hélicoïdale (paramètres hélicoïdaux) de micrographies numérisés, une étape essentielle pour la 3D hélicoïdale de reconstruction. Brièvement, on obtient une carte de la densité initiale de 3D en appliquant la méthode IHRSR. Cette carte initiale est ensuite itérativement affiné par l&#39;introduction de contraintes pour les paramètres d&#39;alignement de chaque segment, de manière à contrôler leurs degrés de liberté. Une nouvelle amélioration est obtenue en corrigeant pour la fonction de transfert de contraste (FCE) du microscope électronique (correction d&#39;amplitude et phase) et en optimisant la symétrie hélicoïdale de l&#39;assemblée.

Watch this Scientific Journal Video about Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction at JoVE.com

Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Cet article décrit une méthode pour obtenir un en trois dimensions (3D) la structure des molécules hélice assemblés par cryo-microscopie électronique. Dans ce protocole, nous utilisons assemblées VIH-1 capside pour illustrer la procédure de reconstruction 3D détaillée pour réaliser une carte de densité par la méthode itérative de reconstruction hélicoïdale espace réel.

Structure du VIH-1 Assemblées capside par cryo-microscopie électronique et reconstruction itérative hélicoïdal espace réel

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein ...

structure-hiv-1-capsid-assemblies-cryo-electron-microscopy-iterative

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.3K vues.  University of Pittsburgh School of Medicine. Cet article décrit une méthode pour obtenir un en trois dimensions (3D) la structure des molécules hélice assemblés par cryo-microscopie électronique. Dans ce protocole, nous utilisons assemblées VIH-1 capside pour illustrer la procédure de reconstruction 3D détaillée pour réaliser une carte de densité par la méthode itérative de reconstruction hélicoïdale espace réel.

Vidéo: Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Assessment of Immunologically Relevant Dynamic Tertiary Structural Features of the HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence by ab initio Folding

The antigenic diversity of HIV-1 has long been an obstacle to vaccine design, and this variability is especially pronounced in the V3 loop of the virus' surface envelope glycoprotein. We previously proposed that the crown of the V3 loop, although dynamic and sequence variable, is constrained throughout the population of HIV-1 viruses to an immunologically relevant &beta;-hairpin tertiary structure. Importantly, there are thousands of different V3 loop crown sequences in circulating HIV-1 viruses, making 3D structural characterization of trends across the diversity of viruses difficult or impossible by crystallography or NMR. Our previous successful studies with folding of the V3 crown1, 2 used the ab initio algorithm 3 accessible in the ICM-Pro molecular modeling software package (Molsoft LLC, La Jolla, CA) and suggested that the crown of the V3 loop, specifically from positions 10 to 22, benefits sufficiently from the flexibility and length of its flanking stems to behave to a large degree as if it were an unconstrained peptide freely folding in solution. As such, rapid ab initio folding of just this portion of the V3 loop of any individual strain of the 60,000+ circulating HIV-1 strains can be informative. Here, we folded the V3 loop of the R2 strain to gain insight into the structural basis of its unique properties. R2 bears a rare V3 loop sequence thought to be responsible for the exquisite sensitivity of this strain to neutralization by patient sera and monoclonal antibodies4, 5. The strain mediates CD4-independent infection and appears to elicit broadly neutralizing antibodies. We demonstrate how evaluation of the results of the folding can be informative for associating observed structures in the folding with the immunological activities observed for R2.

Assessment of Immunologically Relevant Dynamic Tertiary Structural Features of the HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence by ab initio Folding

The crown region of different V3 loop sequences of the surface envelope glycoprotein (gp120) of HIV-1 can be structurally characterized in many cases by in silico folding of positions 10 to 22 of the loop using a state-of-the-art ab initio folding algorithm. Here we demonstrate the folding and evaluation of this region of the V3 loop from the R2 strain of HIV-1, a uniquely neutralization sensitive strain with puzzling functional properties.

Évaluation des immunologiquement pertinents dynamiques tertiaires Caractéristiques structurelles de l&#39;épidémie de VIH-1 séquence de la boucle V3 de la Couronne par R2<em&gt; Ab initio</em&gt; Pliante

The antigenic diversity of HIV-1 has long been an obstacle to vaccine design, and this variability is especially pronounced in the V3 loop of the virus' ...

Recherche

Immunologie et infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Inférence génotypique de tropisme du VIH-1 en utilisant la population basée séquençage du V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) such investigations can take several days1,2 and are therefore not suited for a rapid diagnosis of plant virus diseases. Microwave fixation can be used to drastically reduce sample preparation time for TEM investigations with similar ultrastructural results as observed after conventionally sample preparation3-5. Many different custom made microwave devices are currently available which can be used for the successful fixation and embedding of biological samples for TEM investigations5-8. In this study we demonstrate on Tobacco Mosaic Virus (TMV) infected Nicotiana tabacum plants that it is possible to diagnose ultrastructural alterations in leaves in about half a day by using microwave assisted sample preparation for TEM. We have chosen to perform this study with a commercially available microwave device as it performs sample preparation almost fully automatically5 in contrast to the other available devices where many steps still have to be performed manually6-8 and are therefore more time and labor consuming. As sample preparation is performed fully automatically negative staining of viral particles in the sap of the remaining TMV-infected leaves and the following examination of ultrastructure and size can be performed during fixation and embedding.

This study describes a method that allows the rapid and clear diagnosis of plant virus diseases in about half a day by using a combination of microwave assisted plant sample preparation for transmission electron microscopy and negative staining methods.

Micro-ondes assistée diagnostic rapide des maladies virales des plantes par microscopie électronique à transmission

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by the majority of HIV strains in order to infect the human immune cells (Fig. 1). Other HIV isolates use a different coreceptor, the CXCR4. Which receptor is used, is determined in the virus by the Env protein (Fig. 2). Depending on the coreceptor used, the viruses are classified as R5 or X4, respectively. MVC binds to the CCR5 receptor inhibiting the entry of R5 viruses into the target cell. During the course of disease, X4 viruses may emerge and outgrow the R5 viruses. Determination of coreceptor usage (also called tropism) is therefore mandatory prior to administration of MVC, as demanded by EMA and FDA. 
The studies for MVC efficiency MOTIVATE, MERIT and 1029 have been performed with the Trofile assay from Monogram, San Francisco, U.S.A. This is a high quality assay based on sophisticated recombinant tests. The acceptance for this test for daily routine is rather low outside of the U.S.A., since the European physicians rather tend to work with decentralized expert laboratories, which also provide concomitant resistance testing. These laboratories have undergone several quality assurance evaluations, the last one being presented in 20111.
For several years now, we have performed tropism determinations based on sequence analysis from the HIV env-V3 gene region (V3)2. This region carries enough information to perform a reliable prediction. 
The genotypic determination of coreceptor usage presents advantages such as: shorter turnover time (equivalent to resistance testing), lower costs, possibility to adapt the results to the patients' needs and possibility of analysing clinical samples with very low or even undetectable viral load (VL), particularly since the number of samples analysed with VL&lt;1000 copies/&mu;l roughly increased in the last years (Fig. 3).
The main steps for tropism testing (Fig. 4) demonstrated in this video: 
1. Collection of a blood sample 
 2. Isolation of the HIV RNA from the plasma and/or HIV proviral DNA from blood mononuclear cells 
 3. Amplification of the env region 
 4. Amplification of the V3 region 
 5. Sequence reaction of the V3 amplicon 
 6. Purification of the sequencing samples 
 7. Sequencing the purified samples 
 8. Sequence editing 
 9. Sequencing data interpretation and tropism prediction

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

The prediction of the coreceptor usage of HIV-1 is required for the administration of a new class of antiretroviral drugs, i.e. coreceptor antagonists. It can be performed by sequence analysis of the env gene and subsequent interpretation through an internet based interpretation system (geno2pheno[coreceptor]).

Prédiction du VIH-1 Utilisation corécepteur (tropisme) par analyse de séquence en utilisant une approche génotypique

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

En décapsidation in vitro du VIH-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

De nouveaux outils pour multiplier des cellules T régulatrices de personnes VIH-1-infected

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

L&#39;évaluation de l&#39;Innate détection du VIH-1 CD4 infectés<sup&gt; +</sup&gt; Cellules T par les cellules dendritiques plasmacytoïdes Utilisation d&#39;un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Système de co-culture.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Évaluation de conformation du VIH-1 trimère glycoprotéines d&#39;enveloppe l&#39;aide d&#39;un base de cellules test ELISA

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

Isolement des exosomes dans le plasma du VIH-1 individus positifs

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Mesure de<em&gt; In vitro</em&gt; Activité d&#39;intégration du VIH-1 préintégration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...