Ce travail a été soutenu par la Société Max Planck (KMD, BD, MN, la tuberculose, TBB, DJM, et WK), le pôle d&#39;excellence de Francfort &quot;macromoléculaires complexes», financé par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (WK) et un EMBO long terme postdoctoral Fellowship (VAMG).

1 Préparation des mitochondries à partir de cellules ou de tissus humains par centrifugation différentielle Cette section décrit une procédure générale pour l&#39;isolement des mitochondries intactes de différents organismes eucaryotes. La précision des composants du tampon et de la vitesse de centrifugation doivent être optimisés pour chaque tissu / espèces étudiées. <ol><li> Faire éclater les cellules dans un tampon isotonique (par exemple, 250 mM de saccharose, 10 mM d&#39;HEPES pH 7,4), en utilisant un broyeur à billes de verre (mycélium) 28, une digestion enzymatique de la paroi cellulaire (Saccharomyces cerevisiae) 29, d&#39;un homogénéisateur à roulement à billes (single -Chargeur eucaryotes / cellules / culture) 30 nematodes, ou un mélangeur (de tissus animaux ou végétaux) 31. </li><li> Éliminer les débris cellulaires par filtration à travers une mousseline suivie d&#39;une centrifugation à basse vitesse (2000 x g, 4 ° C, 10 min). </li><li> Recueillir surnageant et de culot de mitochondries par centrifugation à grande vitesse (9000 xg, 4 ° C, 10 min). </li><li> Si nécessaire, utiliser un gradient de densité isotonique étape de purification supplémentaire de la fraction mitochondriale 32. </li></ol> 2 Préparation des mitochondries pour cryo-tomographie La section suivante décrit comment obtenir les échantillons congelés-hydratés pour cryo-ET. REMARQUE: La méthode implique l&#39;utilisation de l&#39;azote liquide extrêmement froid et de l&#39;éthane, qui peut causer de graves brûlures de la peau. des lunettes de protection et des gants cryo-protection doivent être portés. Éthane liquide, qui est également inflammable, doit être traitée dans une hotte de laboratoire. <ol><li> Remettre en suspension les mitochondries culot dans 250 mM de tréhalose, 10 mM de tampon HEPES à pH 7,4 à une concentration d&#39;environ 5 mg / ml de protéine totale. </li><li> Décharge luminescente grilles EM trouée de carbone, du carbone jusqu&#39;à latérales, dans un dispositif à vide selon les instructions du fabricant. </li><li> Liquéfier quelques millilitres d&#39;éthane en dirigeant un courant de gaz d&#39;éthane sur le côté intérieur d&#39;un froid de l&#39;azote liquiderécipient en aluminium éd. </li><li> Mélanger la suspension de repère d&#39;or de la protéine A conjuguée à 1: 1 avec suspension mitochondriale et appliquer immédiatement 3 pi à un réseau EM décharge luminescente qui s&#39;est tenue à pinces. </li><li> Placez la pince à épiler dans un dispositif de vitrification, par exemple, une guillotine fait maison. Éponger l&#39;excès de liquide avec un coin de papier filtre (~ 5 secondes ou jusqu&#39;à ce que le liquide cesse d&#39;étalement) et plonger immédiatement dans la grille de l&#39;éthane liquide en relâchant la gâchette. </li><li> Transférer la grille à partir d&#39;éthane liquide dans l&#39;azote liquide. Pendant le transfert, enlever l&#39;excès d&#39;éthane à partir de la grille avec un papier filtre. Placez l&#39;extrémité d&#39;un morceau de papier filtre en forme de coin dans la éthane liquide. Comme l&#39;éthane liquide monte doucement glisser la grille le papier du filtre, mais le garder au-dessous du front de liquide. Éthane liquide est retiré de la grille par une action capillaire, et une fois tous éthane liquide a été retiré, transférer immédiatement la grille dans l&#39;azote liquide. </li><li> Placer la grille vitrifiés dans une boîte de rangement de grille, unee stocker de l&#39;azote liquide pour une utilisation ultérieure, le cas échéant. </li></ol> 3 Enregistrement des tomographique Tilt Series La section suivante décrit comment mettre en place et de recueillir une série d&#39;inclinaison tomographique d&#39;une mitochondrie avec un microscope électronique à Polara équipé d&#39;un filtre d&#39;énergie post-colonne et d&#39;une caméra CCD. Des protocoles similaires sont utilisés avec tous les électrons cryo-microscopes équipés de caméras CCD ou directs de détection électronique. <ol><li> Aligner le microscope <ol><li> Insérez éprouvette par exemple, le graphite et les îles d&#39;or sur le film de carbone à trous. </li><li> Sélectionnez le mode de recherche dans le système à faible dose du microscope. </li><li> Amener l&#39;échantillon à la hauteur eucentrique. C&#39;est le point de déplacement xy minimal lors de l&#39;inclinaison du porte-échantillon. Centrer un point d&#39;intérêt à 0 ° d&#39;inclinaison, l&#39;inclinaison de la scène à 20 ° et recentrer le point en modifiant la hauteur z. Retour à 0 ° et répéter jusqu&#39;à ce décalage latéral est minimisé. </li><li> Sélectionnermode d&#39;exposition. Choisissez agrandissement souhaité pour la collecte d&#39;une tomographie (par exemple, 25,000X sur le détecteur ≈ 0,6 nm Taille de l&#39;échantillon de pixels). </li><li> Choisissez une ouverture du condenseur de petite taille (50-70 mm) et sélectionnez une taille de spot et de l&#39;intensité du faisceau de sorte que le faisceau est juste plus large que le dispositif d&#39;imagerie et donne une lecture de pixel de 60 e - / pixel (CCD) ou 14 e - / pixel / s (détecteur d&#39;électrons direct, mode de comptage). </li><li> Centre d&#39;ouverture du condenseur. </li><li> Trouver gaussien accent par exemple, point de contraste minimal. Réinitialiser le microscope lecture de défocalisation et des points de pivotement et de corriger le centre de rotation selon les instructions du fabricant. </li><li> Cadran en défocalisation souhaité pour l&#39;enregistrement de tomographie. REMARQUE: Haute défocalisation (8 pm) augmente le contraste mais réduit la résolution, alors qu&#39;une faible défocalisation (2-4 pm) augmente la résolution au détriment de contraste. </li><li> Sur un trou vide, générer une nouvelle référence de gain et aligner filtre d&#39;énergie selon le fabricant deinstructions. </li><li> Alignez les modes de recherche et d&#39;exposition. En mode d&#39;exposition, centre un point d&#39;intérêt et de passer en mode de recherche. Choisir un grossissement de 1,500X (0,033 um / pixel de l&#39;échantillon sur le détecteur) et défocalisation de 100 um (pour augmenter le contraste). Apportez point d&#39;intérêt retour à centrer utilisant des bobines de décalage d&#39;image. </li><li> En mode de recherche, ajustez la taille du spot et de l&#39;intensité du faisceau de sorte que le faisceau est juste plus large que le dispositif d&#39;imagerie et donne une lecture de pixel d&#39;environ 20 e - / pixel (CCD) ou ~ 8 e - / pixel / sec détecteur d&#39;électrons direct (, mode de comptage). </li></ol></li><li> Trouver une zone de bon spécimen <ol><li> Insérez la grille avec des mitochondries congelés-hydratés dans le microscope électronique à la température de l&#39;azote liquide (reportez-vous aux instructions du fabricant EM). </li><li> En mode de recherche, la recherche de la grille pour les zones de l&#39;épaisseur de la glace et de l&#39;échantillon qualité appropriée. Prenez une photo de recherche de 6 sec de domaines prometteurs pour déterminer l&#39;aptitude pour la collecte de tomographie. Both la membrane mitochondriale interne et externe doit être visible à ce grossissement. </li></ol></li><li> Enregistrement d&#39;une série Tilt tomographique <ol><li> Une fois une bonne surface de l&#39;éprouvette se trouve, inclinez la scène ± 60 ° pour déterminer la plage d&#39;inclinaison maximale qui est disponible sans aucune obstruction de l&#39;exposition ou la zone de mise en barreaux de la grille ou des morceaux de glace. </li><li> Sur un trou rempli de glace à proximité d&#39;apparence similaire, changer de mode d&#39;exposition et d&#39;ajuster l&#39;intensité du faisceau ou de l&#39;acquisition de l&#39;image du temps de sorte que chaque image enregistrée a une dose d&#39;électrons de 30-50 e - / pixel pour CCD ou 6-8 e - / pixel / s détecteurs d&#39;électrons directs, mode comptage. </li><li> Calculer le rapport de distribution de dose (I 0 / I 60) en divisant le nombre moyen d&#39;électrons pour une image acquise pendant 1 seconde à 0 ° avec celle de l&#39;image de 60 °. Ce rapport décrit l&#39;augmentation du temps d&#39;exposition nécessaire pour maintenir un taux constant d&#39;électrons par image avec l&#39;augmentation de l&#39;angle d&#39;inclinaison (= temps d&#39;exposition 1 / cos (α) n où (I 0 / I 60) = 2 n). Le rapport est aussi une bonne indication de l&#39;épaisseur de la glace. Bonnes tomographies de mitochondries sont généralement enregistrés avec un I 0 / I 60 = 2.3-2.6. </li><li> Sur un trou vide, d&#39;acquérir une image de 1 sec en mode d&#39;exposition et de noter le nombre d&#39;électrons par Å 2. Prenant en compte le rapport de distribution de dose, calculer le nombre total d&#39;images pouvant être enregistrées pour une dose totale spécifique d&#39;électrons (par exemple, &lt;40 e - / Å 2 pour la détermination de la structure et ~ 160 e - / Å 2 pour la morphologie). </li><li> Déterminer l&#39;intervalle d&#39;inclinaison approprié pour la collecte de tomographie en divisant la plage verticale (par exemple, 120 ° pour ± 60 °) par le nombre total d&#39;images calculées en 3.3.4. </li></ol></li><li> Mettre en place et enregistrer une tomographie avec les paramètres déterminés ci-dessus en utilisant un logiciel de collecte automatique de données approprié 33, 34. série Tilt débute habituellement à ± 20 ° et passent par 0 ° avant d&#39;atteindre élevés s&#39;incline afin de maximiser le contenu de l&#39;information d&#39;images à faible inclinaison qui est détruit par augmentation de la dose d&#39;électrons. </li></ol> 4 Création et segmentation des volumes tomographiques Cette section décrit comment volumes tomographiques de mitochondries sont générés à partir de séries d&#39;inclinaison et la façon dont les volumes sont présents pour l&#39;affichage général. <ol><li> Enregistrer la série tomographique d&#39;inclinaison pour un répertoire approprié. Générer une pile d&#39;images et de les convertir dans un format de fichier approprié avec le logiciel open-source, comme dm2mrc ou tif2mrc (paquet MID), qui convertissent .dm3, .dm4 ou .tif fichiers à piles mrc. mrc piles sont nécessaires pour la reconstruction tomographique avec MID 35. Autres forfaits exigent des formats. </li><li> Aligner les images et générer une tomographie en suivant les étapes décrites dans le tutoriel MID ( <ahref=&quot;http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html&quot;&gt;http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html ). </li><li> Améliorer le contraste de l&#39;tomogramme en utilisant le filtre de diffusion anisotrope non linéaire distribués avec IMOD. Ce filtre fonctionne bien pour les membranes et les particules associées à la membrane, tels que l&#39;ATP synthase. </li><li> Pour la visualisation, le segment manuellement la tomographie en utilisant des programmes disponibles dans le commerce par exemple, Amira. Attribuer voxels correspondant à la membrane interne ou externe et de générer une surface. Utilisation de l&#39;option de clicker dans le plugin EM-paquet pour AMIRA 36 marquer l&#39;emplacement des particules de l&#39;ATP synthase. </li></ol> 5. Subtomogram Moyenne de l&#39;ATP synthase dimères et pose de X-Ray Structures La section suivante décrit comment moyennes subtomogram de l&#39;ATP synthase dimères peuvent être obtenus. <ol><li> En utilisant les particules marquées en entrée et un logiciel approprié tel que la «PartieEstimation icle programme tomographie électronique »pour, calculer une moyenne de subtomogram. </li><li> Pour obtenir une estimation de la résolution, de comparer deux moyennes de subtomogram déterminés indépendamment par Fourier coque corrélation 37. </li><li> Si disponibles, quai connu structures de rayons X dans la moyenne de subtomogram par corps rigide montage, soit manuellement, soit en utilisant des routines automatiques d&#39;accueil séquentiel, tels que ceux du programme Chimera 38. </li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Le protocole présenté ici fournit une introduction de cryo-ET et subtomogram moyenne des mitochondries, mais essentiellement la même procédure peut être appliquée à n&#39;importe quel autre compartiment de la cellule ou de la membrane. Pour obtenir les meilleures données possibles, les étapes critiques de la procédure sont la préparation des échantillons, la stratégie d&#39;acquisition de données et des processus de congélation plongeon. Qualité échantillon, ce qui est essentiel pour le succès, dépend d&#39;un protocole de congélation optimisé pour garantir une épaisseur de glace appropriée, qui est d&#39;une importance primordiale pour un bon contraste d&#39;image. La stratégie optimale d&#39;acquisition de données dépend de l&#39;instrument et de l&#39;échantillon. Paramètres à optimiser comprennent dose d&#39;électrons par image, système d&#39;inclinaison et défocalisation. L&#39;acquisition d&#39;une bonne tomographie d&#39;un bon échantillon rend tout traitement ultérieur étapes plus facile et assure un résultat final satisfaisant. Cryo-ET combiné avec subtomogram moyenne et atomique ajustement du modèle fournit des détails sur la façon dont les complexes de protéines sont disposées en eenvironnement cellulaire natif leu. La technique est également adaptée à l&#39;étude de la structure de grands complexes de protéines membranaires, tels que supercomplexes respiratoires de chaîne (1,7 MDA), les dimères de l&#39;ATP synthase (2x500 kDa), ou le complexe du pore nucléaire (~ 120 MDa) 8, 9, 17. L&#39;organisation de l&#39;ATP dimères synthase en lignes ne peut être observée par des techniques à haute résolution tels que la cristallographie aux rayons X, RMN ou une particule cryo-EM, parce que les rangées de dimères sont perturbés par extraction au détergent, qui est une étape nécessaire dans l&#39;isolement et la purification de complexes protéiques de la membrane. L&#39;agencement de l&#39;ATP synthase dans des rangées de dimères long des crêtes de crêtes est un principe d&#39;organisation universelle des mitochondries dans toutes les espèces. Les complexes de pompage de protons de la chaîne de transport d&#39;électrons, en particulier complexe I (NADH déshydrogénase), sont situés dans les zones de chaque côté des rangées de membrane 8,9. Cette organisation de la chaîne respiratoire a un impact profond sur la bioénergétique mitochondriale. Si les rangées de dimères ne peuvent se former en raison de l&#39;absence de sous-unités protéiques spécifiques aux dimères, les cellules présentent des temps de génération et de remise en forme cellulaire réduite, comme observé dans le mutant de levure représenté sur la figure 3 41. Avec l&#39;intérêt croissant pour les maladies mitochondriales, un détail compréhension de la base moléculaire régissant ultrastructure et la fonction mitochondriale est d&#39;une importance primordiale. Cryo-tomographie fournit un lien entre la structure de la protéine déterminée par des méthodes à haute résolution, et la distribution et la disposition de ces protéines dans la membrane à l&#39;échelle du nanomètre. Cela rend cryo-ET un outil essentiel pour comprendre la structure et la fonction mitochondriale dans la santé et la maladie. Développements et améliorations techniques complémentaires en cryo-ET comprennent des stratégies protéine d&#39;étiquetage pour identifier la position de protein sous-unités dans des complexes macromoléculaires ou la localisation de protéines distinctes plus petites ou moins (&lt;0,5 Mda) dans les cellules. En outre, les méthodes de traitement hybride EM, qui se combinent avec une moyenne subtomogram analyse de particules isolées ou de reconstruction hélicoïdale ont récemment déterminé les structures des protéines à ~ 8 A 42, 43. Ces méthodes de traitement sont actuellement limitées aux protéines purifiées, qui sont bien séparés dans la glace ou forment des ensembles hélicoïdaux et sont actuellement pas applicable aux environnements cellulaires très fréquentés comme les mitochondries et les membranes des crêtes. Pour la collecte des données, de nouveaux outils informatiques et de matériel sont en cours d&#39;élaboration pour permettre l&#39;acquisition de tomographie automatisée, augmenter le contraste d&#39;image et de réduire la dose totale d&#39;électrons nécessaire. La seule limitation fondamentale dans cryo-ET est dégâts d&#39;irradiation de l&#39;échantillon par le faisceau d&#39;électrons. Cela signifie que seulement de très faibles doses d&#39;électrons peuvent être utilisés pour enregistrer chaque image d&#39;une série d&#39;inclinaison tomographique, entraînant un mauvais rapport signal trapport qui limite finalement la résolution réalisable o-bruit. Les nouveaux détecteurs d&#39;électrons directe, publié il ya moins d&#39;un an, sont actuellement en train de révolutionner le domaine de la seule particule cryo-EM 44, 45. Ces nouveaux détecteurs offrent un contraste plus élevé et une meilleure résolution à des doses plus faibles d&#39;électrons. Par cryo-tomographie, cela signifie que les séries de basculement avec de plus petites tailles de pas ou des tomographies de l&#39;axe même doubles peuvent être collectées sans s&#39;inquiéter de dégâts d&#39;irradiation excessive (une image CCD est équivalente à la dose d&#39;électrons de 5 images directes de détecteur d&#39;électrons). Les vastes quantités de données produites par ces détecteurs de créer leurs propres défis en matière de manutention, le traitement et le stockage, qui devront être surmontés. En outre, les plaques de phase, qui fonctionnent sur ​​les mêmes principes que ceux qui sont utilisés en routine dans la microscopie optique pour augmenter le contraste de phase, sont actuellement en cours de développement pour la microscopie électronique à transmission 46, 47. Cela devrait permettre tomographies à collecter plus proche de focaliser et donc à la résolution plus élevée, tout en préservant en même temps basse résolution propose nécessaire pour l&#39;alignement et l&#39;interprétation des volumes tomographiques. Pris ensemble, ces avancées technologiques seront grandement élargir la gamme des questions biologiques qui peuvent être traités par cryo-ET.

Les mitochondries sont les centrales d&#39;énergie de la cellule. Par conversion d&#39;un gradient de proton électrochimique à travers la membrane mitochondriale interne en énergie de liaison chimique, l&#39;ATP synthase mitochondriale produit la plupart de l&#39;ATP qui entraîne des processus cellulaires. Afin de comprendre les mécanismes sous-jacents conversion d&#39;énergie mitochondriale, nous avons besoin de déterminer la structure de l&#39;ATP synthase in situ, et pour savoir comment il est organisé et distribué dans la membrane mitochondriale interne. Bien que les structures à haute résolution de la plupart des composants mitochondriaux de l&#39;ATP synthase 3.1 et cartes à faible résolution de l&#39;ensemble du complexe 4 sont disponibles, il est important d&#39;établir la structure et la conformation de l&#39;enzyme active dans la membrane. La distribution de l&#39;ATP synthase dans la membrane mitochondriale interne a été largement supposé être aléatoire, mais un début de trouver 5 et nos propres résultats initiaux 6 indiqué que ce n&#39;est pas til cas. Des études ultérieures de notre groupe et d&#39;autres 7 ont confirmé que l&#39;ATP synthase est disposé dans de longues rangées de dimères sur les crêtes étroitement courbes de la mitochondriale interne crêtes de la membrane 8, tandis que les pompes à protons de la chaîne de transport d&#39;électrons semblent être situés de chaque côté des lignes 9. Cette disposition a d&#39;importantes implications pour les mécanismes de conversion d&#39;énergie mitochondriale. La technique que nous avons utilisée pour déterminer cette disposition est cryo-tomographie (cryo-ET). Cryo-ET est actuellement la seule méthode qui offre précises volumes en trois dimensions (3D) de cellules, des compartiments cellulaires ou des organites à une résolution moléculaire. Cryo-ET est particulièrement adapté à l&#39;étude de grands complexes dans les membranes biologiques, car les membranes apparaissent avec un bon contraste et sont faciles à tracer des volumes tomographiques en 3D. D&#39;autres méthodes pour étudier la structure 3D de cellules ou organelles ne donnent pas de détails moléculaire. Super-résolution de la microscopie à lumière 10, 11 est excellent en révélant la position ou la distance entre les marqueurs luminescents liés à des protéines d&#39;intérêt avec une précision de quelques dizaines de nm, mais il ne révèle pas la structure de la protéine elle-même, même à basse résolution . microscopie électronique à transmission de coupes en série 12 ou imagerie îlot par microscopie électronique à balayage 13 d&#39;échantillons biologiques plastique intégré offrent une vue basse résolution de volumes cellulaires, mais également ne pas révéler les détails moléculaire. La microscopie à force atomique 14 peut en principe délivrer résolution moléculaire ou atomique même, mais seulement à la surface des objets sur un support solide atomiquement plat. Enfin, tomographie par rayons X 15 ou diffusion de intenses impulsions de rayons X par des lasers à électrons libres 16 est peu probable pour révéler la structure de grands complexes, objets apériodiques comme les cellules ou les organites entiers à mrésolution olecular dans un avenir prévisible. Ainsi à l&#39;heure actuelle, il n&#39;y a pas d&#39;alternative à cryo-ET pour les études de la structure 3D de cellules ou organites à résolution nanométrique. Cryo-ET est la méthode de choix pour l&#39;examen de la structure et la conformation des assemblages de protéines associées à la membrane, y compris le complexe du pore nucléaire 17, le pic de la grippe se complexe 18, et les flagelles des protéines motrices 22, 23, mais également l&#39;organisation des cellules bactériennes entières 19 et l&#39;entrée de virus pathogènes comme le VIH dans les cellules 20-23. Cryo-ET est inestimable pour la visualisation de protéines filamenteuses et leurs interactions dans la cellule, dont les filaments d&#39;actine 24 ou axonèmes 25. La résolution peut être améliorée à 2 nm ou mieux par subtomogram moyenne 26, dans lequel sont découpées sous-volumes de répétition, des traits réguliers sur un volume tomographique et en moyenne par une particule d&#39;image prodes techniques de transformation. Cryo-ET comprend l&#39;acquisition d&#39;une série d&#39;images de projection d&#39;un spécimen mince (&lt;250 nm d&#39;) prises sous différents angles d&#39;inclinaison dans un microscope électronique à transmission (MET). Le spécimen doit être mince pour que des électrons qui interagissent fortement avec la matière, sont dispersés plus d&#39;une fois. Diffusion multiple rend les images qui en résultent difficiles à interpréter et réduit le contraste. Les images de la zone sélectionnée de l&#39;échantillon sont alignés par rapport à l&#39;autre et prévus dans un espace 3D par un programme informatique approprié, la génération d&#39;un volume 3D de l&#39;échantillon. L&#39;alignement des images est assisté par marqueurs fiduciaires or, qui sont mélangés avec l&#39;échantillon avant la congélation. Marqueurs fiduciaires Idéalement 10 ou plus uniformément réparties doivent être présents dans chaque image pour obtenir un bon alignement. Pour observer en détail moléculaire, les échantillons sont congelés plongée dans l&#39;éthane liquide, ce qui préserve leur état hydraté natif. Congélation en liquideéthane est si rapide (~ 10 5 ° C / s) 27 que l&#39;eau ne cristallise pas, mais reste dans un état ​​vitrifié, semblable à du verre. cristaux de glace des dommages-intérêts de la formation des structures biologiques sensibles. Comme échantillons biologiques souffrent de dégâts d&#39;irradiation, il existe une limite pour le nombre total d&#39;événements de diffusion de l&#39;échantillon peut tolérer. Les images sont ainsi acquises en mode à faible dose: Une zone d&#39;intérêt est identifié à faible grossissement (1,500X) avec une dose d&#39;électrons inférieure à 1 e - / nm 2 (mode de recherche). L&#39;image est ensuite porté à un plus fort grossissement, hors de la zone d&#39;intérêt (mode de mise au point). Ce n&#39;est que lorsque l&#39;image est acquise, la zone d&#39;intérêt est irradié avec une dose plus élevée d&#39;électrons (mode d&#39;exposition). Ici, nous présentons un aperçu de la façon de recueillir et d&#39;électrons de processus cryo-tomographie, en utilisant de l&#39;ATP synthase dimères dans la membrane mitochondriale interne comme un exemple. Le protocole suivant décrit comment préparer les mitochondries pour cryo-ET, comment mettre en placeet collecter une série d&#39;inclinaison avec une dose d&#39;électrons totale spécifique, et la manière de traiter la série d&#39;inclinaison pour obtenir un volume 3D de la zone d&#39;intérêt. Une vue d&#39;ensemble de la procédure est illustrée sur la figure 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="961">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Sucrose</td>
			<td style="width:235px;">ROTH</td>
			<td style="width:119px;">4621.2</td>
			<td style="width:379px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Trehalose</td>
			<td style="width:235px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">HEPES</td>
			<td style="width:235px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Zymolase</td>
			<td style="width:235px;">biomol</td>
			<td style="width:119px;">Z1000.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Density gradient medium</td>
			<td style="width:235px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D1556 or P1644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Protein A gold</td>
			<td style="width:235px;">Aurion</td>
			<td style="width:119px;">810.111</td>
			<td>10 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Ethane</td>
			<td style="width:235px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:119px;">P0502S02R0A001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Nitrogen</td>
			<td style="width:235px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:119px;">I4150RG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Consumables</td>
			<td style="width:235px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Filter paper</td>
			<td style="width:235px;">Whatman, GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">1004 090</td>
			<td>Nr 4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Tweezers</td>
			<td style="width:235px;">Dumont</td>
			<td style="width:119px;">T506</td>
			<td>Non-magnetic, pattern #5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">EM combined test grid</td>
			<td style="width:235px;">Plano GmbH</td>
			<td style="width:119px;">S142</td>
			<td>grapite and gold islands on holey carbon film</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Holey carbon grids</td>
			<td style="width:235px;">Quantifoil Micro Tools GmbH or C-flat</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>R2/2 300 Cu mesh&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Cryo grid boxes</td>
			<td style="width:235px;">Plano GmbH</td>
			<td style="width:119px;">160-42</td>
			<td>Alternative home-made metal boxes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Equipment</td>
			<td style="width:235px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Potter</td>
			<td style="width:235px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blender</td>
			<td style="width:235px;">Waring</td>
			<td style="width:119px;">8011S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Glass bead mill - bead beater</td>
			<td style="width:235px;">BioSpec Products</td>
			<td style="width:119px;">1107900-105</td>
			<td>Including 0.5 mm beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ball-bearing (Balch) homogeniser</td>
			<td style="width:235px;">isobiotec</td>
			<td style="width:119px;">H8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:235px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">46915</td>
			<td>Sorvall RC6+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Glow-discharge apparatus</td>
			<td style="width:235px;">Bal-Tec A.G.</td>
			<td style="width:119px;">CTA 010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Grid vitrification device</td>
			<td style="width:235px;">FEI, Gatan or Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Alternative home-made plunger</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Transmission electron microscope</td>
			<td style="width:235px;">FEI or Jeol</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>300 keV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Direct electron detector (CMOS)</td>
			<td style="width:235px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>4k x 4k pixels, counted mode</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Charge coupled device</td>
			<td style="width:235px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>4K x 4K pixels (alternative to Direct electron detector)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Energy filter</td>
			<td style="width:235px;">Gatan or Jeol</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Software</td>
			<td style="width:235px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Image acquisition software</td>
			<td style="width:235px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Tomogram acquisition software</td>
			<td style="width:235px;">Gatan, FEI, USCF, or UC-Boulder</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>4 alternatives</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Tomogram processing software</td>
			<td style="width:235px;">FEI, UCSF or UC-Boulder</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>3 alternatives</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Subtomogram averaging software</td>
			<td style="width:235px;">UC-Boulder, or University of Basel</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>2 alternatives</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Tomogram visualisation software</td>
			<td style="width:235px;">UC-Boulder, FEI, or University of Utah</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>3 alternatives</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">visualisation software plugin</td>
			<td style="width:235px;">Goethe university</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Structure visualisation software</td>
			<td style="width:235px;">UCSF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Numerical calculation software</td>
			<td style="width:235px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.mathworks.de/academia/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of atp synthase dimers in mitochondria by electron cryo-tomography

Electron cryo-tomographie est un outil puissant dans la biologie structurale, capable de visualiser la structure tridimensionnelle d&#39;échantillons biologiques, tels que des cellules, des organites, des vésicules membranaires ou des virus dans des détails moléculaire. Pour ce faire, l&#39;échantillon aqueux est rapidement vitrifié dans l&#39;éthane liquide, qu&#39;il conserve dans un état congelé-hydraté proche de l&#39;origine. Au microscope électronique, les séries d&#39;inclinaison sont enregistrés à la température de l&#39;azote liquide, à partir de laquelle on reconstruit des tomographies 3D. Le rapport signal-sur-bruit du volume tomographique est intrinsèquement faible. Reconnaissables, caractéristiques récurrentes sont renforcées par subtomogram moyenne, qui sous-volumes individuels sont découpés, alignés et moyenne pour réduire le bruit. De cette manière, les cartes 3D avec une résolution de 2 nm ou plus peut être obtenu. Un ajustement des structures disponibles en haute résolution pour le volume 3D produit alors des modèles atomiques de complexes de protéines dans leur environnement natif. Ici, nous montrons comment nous utilisons cryo-tomography pour étudier l&#39;organisation in situ de grands complexes de protéines membranaires dans les mitochondries. Nous constatons que les ATP synthases sont organisées en rangées le long des sommets de dimères à forte courbure de la membrane intérieure de crêtes, alors que le complexe I est distribuée de manière aléatoire dans les régions de la membrane de part et d&#39;autre des rangées. Par subtomogram moyenne, nous avons obtenu une structure de l&#39;ATP synthase mitochondriale le dimère à l&#39;intérieur de la membrane de crêtes.

Cryo-tomographie de mitochondries révèlent clairement la morphologie 3D de l&#39;organite (Figure 2). Segmentation manuelle de membranes dans un volume tomographique illustre la structure de l&#39;une des crêtes dans la mitochondrie. En imagerie de mitochondries à partir de différentes souches de levure knock-out dépourvues de certains composants de la protéine, l&#39;effet de ces protéines sur la morphologie des crêtes peut par évalué. Figure 3 montre une mitochondrie d&#39;une souche de levure dépourvue de sous-unité de l&#39;ATP synthase e. Ce composant du complexe ATP synthase est nécessaire pour la dimérisation de l&#39;ATP synthase mitochondriale. Les mitochondries à partir de cette souche manque les crêtes lamellaire normale des mitochondries de type sauvage (figure 2) et contient à la place d&#39;un certain nombre de compartiments de la membrane interne. Ces compartiments sont soit dépourvues de crêtes ou contiennent de petites invaginations de la membrane en forme de ballons (figure 3). Dans tomogrammes avec un bon contraste, grands complexes de protéines mitochondriales, dans ce cas ATP synthase dimères, sont facilement visibles (Figure 4; Film 1). Les structures des complexes peuvent être déterminés à la résolution de 2-3 nm par subtomogram moyenne (Figure 5; Film 2). Les volumes moyens peuvent être mis de nouveau dans le tomogramme en vue d&#39;évaluer la structure des complexes individuels par rapport à l&#39;autre et à d&#39;autres complexes de protéines dans la membrane (figure 6; Film 3). <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1 organigramme montrant les étapes de la cryo-tomographie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> Figure 2: Morphologie d&#39;une mitochondrie de type sauvage S. Cerevisiae. Tranche de centrale à travers un volume tomographique d&#39;un type sauvage S. mitochondrie cerevisiae (à gauche) et le volume de la surface-rendu correspondant (à droite). Le volume segmenté la membrane externe est représentée en gris et les volumes de la limite intérieure et crêtes membranes en bleu clair. Adapté de Davies et al 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig3highres.jpg" width="500" /> Figure 3 mitochondrie d&#39;une S. Cerevisiae manque une sous-unité nécessaire pourATP synthase dimérisation. Couper à travers le volume tomographique (à gauche) et le volume d&#39;accompagnement (à droite) en surface rendue d&#39;une mitochondrie d&#39;une S. Cerevisiae manque le e de la sous-unité de la protéine nécessaire à l&#39;ATP synthase dimérisation. En comparaison avec la figure 2, la mitochondrie de la souche mutante manque de la normale lamellaire crêtes des mitochondries de type sauvage. Au lieu de cela, la mitochondrie a de nombreux compartiments membranaires intérieure avec soit sans crêtes ou crêtes en forme de ballon. Ainsi cryo-tomographie souligne modifications de la morphologie de la membrane due à la délétion de gènes. Adapté de Davies et al 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig4highres.jpg" width="500" /> Figure 4 mitochondrie du champignon P. anserina. Couper à travers le volume tomographique (à gauche) et le volume de surface-rendu d&#39;accompagnement (à droite) d&#39;une mitochondrie du champignon filamenteux P. anserina. Dans ce tomographie, des rangées de 10 particules nm (têtes de flèches jaunes) sont situés au-dessus des crêtes de la membrane fortement incurvées dans les crêtes de la membrane interne (voir vidéo 1). Ces particules ont été identifiées comme l&#39;ATP synthase dimères par subtomogram moyenne. De Davies et al 9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig4highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> <img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig5highres.jpg" width="500" /> Figure 5 Structure et organisation de l&#39;ATP synthase mitochondriale. Side et vue de dessus montrant la densité électronique d&#39;un dimère ATP synthase de S. c<html> erevisiae tel que déterminé par subtomogram moyenne avec des modèles atomiques équipés (à gauche). Mitochondrial vésicule membranaire interne montrant l&#39;organisation de l&#39;ATP synthase dimères en rangées (à droite). La figure a été produite par le moyen de positionnement subtomogram de l&#39;ATP synthase dimère dans le volume segmenté de la vésicule de la membrane, en utilisant les coordonnées calculées au cours de la moyenne. Adapté de Davies et al 8. Modèles atomiques: F 1 / rotor torique [APB: 2WPD] 39 (bleu et violet); oligomycine conférant sensible protéines PCORO [APB: 2BO5] 40 (vert); fragment de tige périphérique [APB: 2CLY] 1 avec les résidus N-terminaux de [APB: 2WSS] 2 (jaune et rouge) (voir vidéo 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig6highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> <html> _upload / 51228 / 51228fig6highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figure 6 isolé crête vésicule d&#39;un P. anserina mitochondrie. tranches d&#39;un volume tomographique (à gauche) et le volume de surface-rendu d&#39;accompagnement (à droite) d&#39;une vésicule de crête de P. anserina. les densités de protéines dépassant de la membrane sont nettement visibles. Les densités indiquées par des flèches jaunes sont des dimères de l&#39;ATP synthase, comme identifié par subtomogram moyenne. Flèches vertes indiquent des densités identifiées par marquage de l&#39;anticorps comme NADH déshydrogénase (complexe 1, pour plus de détails voir 9). Segmentation des densités de protéines révèle leur organisation dans des crêtes, des dimères de l&#39;ATP synthase (rouge et jaune) qui forment des rangées le long des crêtes des crêtes très incurvés et les complexes NADH déshydrogénase (vert) dans les régions de la membrane de part et d&#39;autre des rangées (voir Film 3). De Davies et al 9.28 / 51228fig7highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Cliquez ici pour agrandir l&#39;image. Film 1 Electron cryo-tomographie d&#39;un P. anserina mitochondrie. Le film montre des tranches successives par un volume tomographique pris d&#39;une mitochondrie du champignon filamenteux P. anserina. Des rangées de l&#39;ATP synthase sont indiqués par des flèches jaunes. Le volume segmenté tensio-rendu indique l&#39;emplacement de l&#39;ATP synthase (sphères jaunes) par rapport à la structure 3D de crêtes. Membrane externe, gris; membrane limite intérieure, bleu transparent; crêtes membranes, bleu opaque. De Davies et al 9. Voir aussi la figure 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie1.mp4" target="_blank">Cliquez ici pour voir la vidéo.</a> Film 2. moyenne de Subtomogram du mitochondriale d&#39;ATP synthase dimère de S. Cerevisiae avec des modèles atomiques équipés. La moyenne était decalculée à partir de 121 sous-volumes. La densité est affiché à trois niveaux de contour: 1s - maille, 2s - gris clair et gris foncé - 3s. Modèles atomiques ont été installés dans la densité en utilisant la routine ajustement séquentiel dans Chimera. Modèles atomiques: F 1 / rotor torique [APB: 2WPD] 39 (bleu et violet); oligomycine conférant sensible protéines PCORO [APB: 2BO5] 40 (vert); fragment de tige périphérique [APB: 2CLY] 1 avec les résidus N-terminaux de [APB: 2WSS]. 2 (jaune et rouge) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie2.mov" target="_blank">Cliquez ici pour voir la vidéo.</a> Adapté de Davies et al 8. Voir aussi la figure 5. Film 3 isolé crêtes vésicule d&#39;un P. anserina mitochondrie. tranches successives à travers le volume tomographique sont présentées, suivie par le volume de la surface-rendu segmenté. densités de protéines qui dépassent de la membrane d&#39;e sont clairement visibles. Densités rouges et jaunes sont des dimères de l&#39;ATP synthase. Densités verts sont NADH déshydrogénase (complexe I), telle que déterminée par marquage de l&#39;anticorps. De Davies et al 9. Voir aussi la figure 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie3.mpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir la vidéo.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography at JoVE.com

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Nous présentons un protocole sur la façon de recueillir et électronique de processus cryo-tomographie de mitochondries entières. La technique donne un aperçu détaillé de la structure, la fonction et l&#39;organisation de grands complexes de protéines membranaires en membranes biologiques indigènes.

Visualisation de l&#39;ATP synthase dimères dans les mitochondries par cryo-tomographie

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

visualization-atp-synthase-dimers-mitochondria-electron-cryo

Research

JoVE Journal

Biology

29.4K vues.  Max Planck Institute of Biophysics.  Nous présentons un protocole sur la façon de recueillir et électronique de processus cryo-tomographie de mitochondries entières. La technique donne un aperçu détaillé de la structure, la fonction et l'organisation de grands complexes de protéines membranaires en membranes biologiques indigènes. 

Vidéo: Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

Multi-paramètres de mesure de l&#39;ouverture des pores de transition de perméabilité dans le Cœur de souris mitochondries isolées

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Recherche

Biologie

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial dysfunction often accompanies and contributes to human disease. Majority of the approaches that have been developed to evaluate mitochondrial function and dysfunction are based on in vitro or ex vivo measurements. Results from these experiments have limited ability in determining mitochondrial function in vivo. Here, we describe a novel approach that utilizes confocal scanning microscopy for the imaging of intact tissues in live aminals, which allows the evaluation of single mitochondrial function in a real-time manner in vivo. First, we generate transgenic mice expressing the mitochondrial targeted superoxide indicator, circularly permuted yellow fluorescent protein (mt-cpYFP). Anesthetized mt-cpYFP mouse is fixed on a custom-made stage adaptor and time-lapse images are taken from the exposed skeletal muscles of the hindlimb. The mouse is subsequently sacrificed and the heart is set up for Langendorff perfusion with physiological solutions at 37 &deg;C. The perfused heart is positioned in a special chamber on the confocal microscope stage and gentle pressure is applied to immobilize the heart and suppress heart beat induced motion artifact. Superoxide flashes are detected by real-time 2D confocal imaging at a frequency of one frame per second. The perfusion solution can be modified to contain different respiration substrates or other fluorescent indicators. The perfusion can also be adjusted to produce disease models such as ischemia and reperfusion. This technique is a unique approach for determining the function of single mitochondrion in intact tissues and in vivo.

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal scanning microscopy is applied for imaging single mitochondrial events in perfused heart or skeletal muscles in live animal. Real-time monitoring of single mitochondrial processes such as superoxide flashes and membrane potential fluctuations enables the evaluation of mitochondrial function in a physiologically relevant context and during pathological perturbations.

Imagerie confocale de simples mitochondriales superoxyde Flashs à coeur Intact ou<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Isolement rapide et la purification des mitochondries pour la transplantation par la dissociation des tissus et différencié Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo suivi 4-Dimensional de hématopoïétiques cellules souches et progénitrices adultes dans la voûte du crâne de souris de moelle osseuse

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

Immunodétection de la membrane externe de protéines par cytométrie en flux de mitochondries isolées

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in cell biology. Many phenomena cannot be explained by in vitro analysis in simplified systems and need additional structural information in situ, particularly in the range between 1 nm and 0.1 &#181;m, in order to be fully understood. Here, electron spectroscopic imaging, a transmission electron microscopy technique that allows simultaneous mapping of the distribution of proteins and nucleic acids, and an expression tag, miniSOG, are combined to study the structure and organization of DNA double-strand break repair foci.

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Visualisation des miniSOG protéines marquées de réparation d&#39;ADN en combinaison avec Electron imagerie spectroscopique (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecal glucocorticoïdes Analyse: Surveillance surrénale non invasive en Equidés

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), are crucial hubs for cellular signaling and cell fate. Particularly, these inter-organelle contact sites allow the transfer of calcium from the ER to mitochondria through the voltage-dependent anion channel (VDAC)/glucose-regulated protein 75 (GRP75)/inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) calcium channeling complex. While this subcellular compartment is under intense investigation in both physiological and pathological conditions, no simple and sensitive method exists to quantify the endogenous amount of ER-mitochondria contact in cells. Similarly, MAMs are highly dynamic structures, and there is no suitable approach to follow modifications of ER-mitochondria interactions without protein overexpression. Here, we report an optimized protocol based on the use of an in situ proximity ligation assay to visualize and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells by using the close proximity between proteins of the outer mitochondrial membrane (VDAC1) and of the ER membrane (IP3R1) at the MAM interface. Similar in situ proximity ligation experiments can also be performed with the GRP75/IP3R1 and cyclophilin D/IP3R1 pairs of antibodies. This assay provides several advantages over other imaging procedures, as it is highly specific, sensitive, and suitable to multiple-condition testing. Therefore, the use of this in situ proximity ligation assay should be helpful to better understand the physiological regulations of ER-mitochondria interactions, as well as their role in pathological contexts.

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Here, we describe a procedure to visualize and quantify with high sensitivity the endogenous interactions between the endoplasmic reticulum and mitochondria in fixed cells. The protocol features an optimized in situ proximity ligation assay targeting the inositol 1,4,5-triphosphate receptor/glucose-regulated protein 75/voltage-dependent anion channel/cyclophilin D complex at the mitochondria-associated membrane interface.

Etude de réticulum endoplasmique et mitochondries Interactions par<em&gt; In Situ</em&gt; Proximité Ligation Assay dans des cellules fixes

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to occur in some cyanobacteria before cell division. However, due to the large cell size and the transient character, it is difficult to investigate the structure in detail. To overcome the difficulties, first, DNA compaction is reproducibly produced in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 by synchronous culture using 12 h each light/dark cycle. Second, DNA compaction is monitored by fluorescence microscopy and captured by rapid freezing. Third, the detailed structure of DNA compacted cells is visualized in three dimensions (3D) by high voltage cryo-electron tomography. This set of methods is widely applicable to investigate transient structures in bacteria, e.g. cell division, chromosome segregation, phage infection etc., which are monitored by fluorescence microscopy and directly visualized by cryo-electron tomography at appropriate time points.

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. Synchronous cultivation, monitoring by fluorescence microscopy, rapid freezing, and high voltage cryo-electron tomography are used. A protocol for these methodologies is presented, and future applications and developments are discussed.

Visualisation de Compaction de l’ADN chez les cyanobactéries par haute tension Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Préparation de l’échantillon biologique par congélation à haute pression, amélioration du contraste assistée par micro-ondes et minime résine enrobage pour l’imagerie de Volume

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...