Notre protocole décrit une méthode de microbroyage à haute résolution pour fabriquer un dispositif microfluidique acrylique pour l’immunodétection quantitative des concentrations d’analytes comparable à la technique ELISA de référence. Le point culminant est la fabrication d’un dispositif microfluidique thermoplastique simple et peu coûteux sans salle blanche, ce qui permet des temps d’analyse plus courts et de bonnes limites de détection de manière quantitative. Commencez par le meulage de surface.
Découpez 9 rectangles de 25 millimètres de PMMA de 1,3 millimètre d’épaisseur avec le taillant de fraisage final de 800 micromètres. Fixez soigneusement l’un de ces rectangles avec du ruban adhésif double face à la plate-forme piézoélectrique. Connectez et placez le capteur Z sur la surface du rectangle en PMMA.
Sélectionnez la broche de détection et déplacez-la sur la surface du capteur. Abaissez la broche manuellement sans entrer en contact avec le capteur. Activez le mode de détection Z-zero.
Faites tourner le taillant d’extrémité de 200 micromètres à 14 500 tr/min. Abaissez-le lentement jusqu’à la coordonnée d’origine sur l’axe z. Réinitialisez ensuite l’axe z à 30 micromètres sous l’origine.
Définissez cette coordonnée comme nouvelle origine Z. Cliquez sur le bouton Couper dans le logiciel de la microfraiseuse pour activer le panneau de coupe. Cliquez sur le bouton Ajouter et sélectionnez le fichier TXT avec un code créé précédemment pour le meulage de la surface acrylique.
Cliquez sur le bouton Sortie pour démarrer le processus. Pour le fraisage de la restriction de cinq micromètres, réglez d’abord la vitesse de rotation du taillant de fraisage final à 11 000 tr/min. Ensuite, soulevez la plate-forme de 6,5 micromètres avec l’interface de la plate-forme piézoélectrique.
Déplacez le taillant d’extrémité le long de l’axe y de 500 micromètres. Ramener la plate-forme piézoélectrique à sa valeur initiale sur l’axe z avec l’interface de contrôle. Ensuite, effectuez le fraisage des microcanaux en ouvrant le fichier de conception créé précédemment à partir du logiciel de conception.
Cliquez sur le bouton Imprimer, accédez au menu des propriétés et cliquez sur la fenêtre couleur correspondant au calque contenant le dessin à usiner. Définissez les paramètres de fabrication dans le panneau d’outils. Pour le fraisage des trous, passez au taillant d’extrémité de 800 micromètres.
Activez la couche de conception des trous de 1,2 millimètre de diamètre en cliquant sur la fenêtre de couleur correspondante et en sélectionnant les paramètres de fabrication correspondants. Usinez deux trous supplémentaires sur les coins controlatéraux du rectangle pour l’alignement de l’acrylique de manière inversée sur une nouvelle plate-forme. Retournez l’acrylique et collez-le avec du ruban adhésif double face sur l’adaptateur avec les piliers usinés.
Ouvrez le fichier avec la conception des trous pour la face opposée du logiciel de conception. Fraisez la moitié restante des trous d’entrée et de sortie du réactif d’un diamètre de 1,5 millimètre et d’une profondeur de 0,7 millimètre. Nettoyez les deux feuilles rectangulaires en acrylique avec de l’alcool isopropylique et rincez à l’eau distillée.
Plongez l’acrylique dans un bain à ultrasons pendant 10 minutes. Sécher les deux feuilles d’acrylique et les coller à l’intérieur d’un couvercle en verre de la boîte de Petri avec du ruban adhésif double face. Ensuite, placez la base de la boîte de Petri en verre à l’intérieur d’une boîte de Petri en verre plus grande.
Versez un millilitre de chloroforme dans la base de la boîte de Petri et placez rapidement le couvercle avec les feuilles d’acrylique. Ajouter immédiatement de l’eau distillée à la base de la plus grande boîte de Petri jusqu’au niveau du couvercle de la boîte de Pétri. Laisser l’acrylique exposé au gaz chloroforme pendant une minute.
Ensuite, inclinez la boîte de Petri pour briser le joint d’eau et découvrez immédiatement la boîte de Pedia. Pour le collage, aligner les deux acryliques avec les côtés exposés au chloroforme face à face et former un sandwich. Placez les acryliques dans la presse pendant deux intervalles de deux minutes, en modifiant l’alignement de l’acrylique.
Ensuite, fixez deux à trois centimètres de tuyau à chacun des trous de l’appareil avec un adhésif liquide à séchage instantané. Remplissez les canaux avec de l’eau distillée à l’aide d’une seringue. Plongez l’appareil dans un bain à ultrasons pendant 10 minutes.
Videz ensuite l’eau à l’intérieur des canaux de l’appareil et utilisez une seringue pour introduire une solution de BSA à 5%. Préparer une suspension de microparticules de fer de diamètre à 7,5 micromètres dans 5% BSA. Incuber la puce et la suspension de microparticules avec la solution bloquante pendant au moins une heure à température ambiante.
Ensuite, insérez les microparticules dans la puce avec une aiguille de seringue à travers le tuyau de sortie du canal latéral. Placez la puce verticalement, puis faites pivoter la puce en deux étapes de 90 degrés de sorte que les microparticules ciblent et se compactent à la restriction de cinq micromètres. Scellez tous les tuyaux de l’appareil en acrylique avec de la chaleur.
Coupez le tuyau d’admission jusqu’à ce qu’il ne reste que quelques millimètres. Remplissez l’aiguille de distribution avec un tampon de lavage et insérez-la dans le tuyau coupé. Laissez la solution s’égoutter, puis connectez l’aiguille à l’appareil.
Coupez le tuyau de sortie du canal latéral, puis connectez-le à la pompe à seringue. Ensuite, répétez la même procédure pour le tuyau de sortie du canal principal. Ensuite, fixez la puce à l’aimant.
Pour l’immunodétection, maintenez le tampon de lavage en écoulement pendant 10 minutes à 50 microlitres par heure. Retirez le tampon de lavage restant de l’aiguille de distribution à l’aide d’une micropipette et ajoutez 50 microlitres de la suspension de nanoparticules. Écoulez la suspension de nanoparticules pendant sept minutes à un débit de 100 microlitres par heure.
Ensuite, modifiez le débit à 50 microlitres par heure et continuez le flux pendant encore 15 minutes. Changez l’aiguille de distribution et faites couler le tampon de lavage pendant 10 minutes au même rythme. Retirez le tampon de lavage restant de l’aiguille de distribution à l’aide d’une micropipette et ajoutez 100 microlitres du substrat fluorogénique.
Ajustez les paramètres de débit et de temps pour l’entrée du substrat, la mesure de fluorescence et l’étape de lavage. Activer le flux d’entrée du substrat fluorogénique pendant six minutes à 50 microlitres par heure. 15 secondes avant l’arrêt de l’écoulement du substrat, activez la fluorescence du microscope.
Démarrez la capture d’image avec le logiciel de la caméra de microscope 10 secondes avant l’arrêt du substrat avec un temps d’exposition de 1 000 millisecondes. Cliquez sur le bouton Démarrer du paramètre de débit souhaité immédiatement après l’arrêt du lavage du substrat. Effectuez des images pendant six minutes à raison d’une image par seconde.
Cliquez sur le bouton Démarrer du flux de lavage immédiatement après l’arrêt du débit de mesure sélectionné. Des nanoparticules conjuguées au lysozyme et des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort ont été utilisés pour le dosage immunologique. Une augmentation de l’intensité de fluorescence pour différentes concentrations d’anticorps primaires a été observée en comparant les régions avant et après le piège, montrant que le changement de fluorescence du substrat est directement proportionnel à la concentration d’anticorps primaires.
Pour une concentration donnée d’anticorps primaires, l’intensité de fluorescence a été tracée en fonction du temps à différents débits du substrat fluorogénique. La capacité de conversion du substrat par l’enzyme HRP était inversement proportionnelle au débit, une intensité maximale a été obtenue pour un débit d’un microlitre par heure. Pour les différents débits pour diverses concentrations d’anticorps primaires, les courbes des différences de fluorescence après et avant immunoréaction ont montré que pour une concentration de 1 000 nanogrammes par millilitre, la fluorescence sature pour tous les débits évalués.
Une courbe d’étalonnage a été préparée en utilisant la valeur maximale des différences d’intensité de fluorescence obtenues par rapport à la concentration d’anticorps primaires pour chaque débit. La grande variabilité et les niveaux de fluorescence élevés à un microlitre par heure suggèrent que la vitesse ne favorise pas l’écoulement du substrat réactif et tend à s’accumuler juste après le piège. Une attention particulière doit être accordée aux étapes d’étanchéité des microcanaux car l’exposition au chloroforme est très sensible à la température.
Pour des résultats reproductibles, la température doit toujours être la même. Notre système aide à comprendre où la compacité et la taille des microparticules, la taille des nanoparticules, les antigènes, les anticorps de détection et le substrat sont des facteurs déterminants pour la limite de détection dans le dosage immunofluidique microfluidique à base de nanoparticules.
