Ce travail a été soutenu par l&#39;Institut national d&#39;imagerie biomédicale et d&#39;accorder Bioingénierie # EB003307 et par le Prix National Science Foundation carrière à la FA

Conception du dispositif microfluidique en utilisant CorelDraw ou le logiciel AutoCAD Principe de PDMS microvannes appareils basés sur: Les appareils se composent de trois couches: une couche contenant fluidiques microchambres de différentes tailles, une &quot;couche de contrôle» contenant des microcanaux nécessaire pour actionner le chemin fluidique avec microvannes, et un milieu fine membrane de PDMS qui est lié à la couche de contrôle. Au repos, en raison de la conformité et l&#39;hydrophobicité de PDMS, les opercules (réversible) contre son siège, donc les chambres restent isolés les uns des autres, sans apport d&#39;énergie. Vannes peut être ouvert par l&#39;application d&#39;une pression négative (par exemple, le vide maison), alors la membrane de PDMS dévie vers le bas et se sépare de la surface qui supporte le mur entre les deux chambres fluidiques, reliant ainsi le chemin fluidique. Fermeture de la vanne peut être réalisé en modifiant le paramètre de pression allant du vide à la pression atmosphérique. Couche fluidique et les schémas couche de contrôle ont été conçus en utilisant CorelDraw ou le logiciel AutoCAD. Masques contenant ces dessins ont été imprimés à haute résolution (8000 à 20000 dpi) sur des films de la transparence grâce à des services commerciaux (CAO / Art, Bandon, OR) (masques non représentée). La fabrication des maîtres de silicium en utilisant la norme SU-8 photolithographie <ol><li> Standard SU-8 méthodes photolithographie ont été utilisés pour créer des SU-8 &quot;maîtres&quot; (SU-8 2050, MicroChem, Newton, MA) pour la couche microfluidique et la couche de commande de la vanne dans une salle blanche (non montré dans cette vidéo). </li><li> Afin de faciliter la libération, avant de réplication PDMS SU-8, ont été les maîtres silanisé par l&#39;exposition à une vapeur d&#39;un fluorosilane ((tridécafluoro-1, 1,2,2,-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane (TFOCS)), dans un jar dessicateur (sans séchage pellets) attaché à une source de vide. La chambre de dessiccateur devra être situé dans une hotte en raison de la nature corrosive des vapeurs TFOCS. </li><li> Placer une petite portion de serviette en papier absorbant à l&#39;intérieur de la chambre de dessiccateur. Ajouter une goutte de TFOCS à l&#39;essuie-tout et d&#39;évacuer l&#39;air de la chambre. Appliquer vide pendant 1 min et éteindre. Fermer le vide et permettre 30 min pour le dépôt. Gardez les maîtres dans des récipients fermés pour une utilisation future. </li></ol> Réplique de moulage de PDMS par les maîtres <ol><li> La couche fluidique et la couche de contrôle sont réalisés par moulage réplique de PDMS de SU-8 maîtres. </li><li> Bien mélanger PDMS pré-polymère et d&#39;agent de reticulation (10:1 en poids. Ratio), de la bulle dans un dessiccateur pendant 10-15 min jusqu&#39;à ce que des bulles claires. </li><li> Couper tube en silicone en morceaux de 1-2 cm de long. Choisissez la taille appropriée du tuyau selon l&#39;application. Nous utilisons des tubes 1,14 mm ID ici pour une connexion facile à un tuyau OD 1 / 16 pouce plus tard. </li><li> Utilisez Duco ® Ciment au tube de colle sur les régions d&#39;entrée de la SU-8 maître de la couche de contrôle. Soyez prudent de ne pas utiliser trop de colle, comme le tube de silicone est constituée des mêmes éléments que le PDMS, et le tube sera intégré dans le dispositif de PDMS microfluidique, la création de l&#39;air et fluidiques entrées serré / sorties. </li><li> Dans notre dispositif, les régions d&#39;entrée sont conçus sur les masques des deux fluides et les couches de contrôle, mais les entrées tube en silicone ne sont moulés en une seule couche (par exemple, la couche de contrôle) de l&#39;appareil. Pour créer les entrées de la couche fluidique, nous enlever manuellement ou perforer les quelques sections de la membrane qui couvre les régions d&#39;entrée. Par conséquent, après l&#39;alignement et le montage, tous les microcanaux (ceux qui portent des flux ainsi que ceux qui contrôlent les valves) sont accessibles depuis le haut de l&#39;appareil de sorte que la surface inférieure est planaire, permettant l&#39;imagerie de l&#39;appareil sur une scène microscope classique. </li><li> Versez délicatement de-bulles sur les deux PDMS maîtres, autour du tube dans le maître de contrôle de la couche. De la bulle à nouveau dans un dessiccateur. Après de-bullage est complète, la mise en 65 ° C four pendant&gt; 1 heure pour le durcissement. </li><li> Retirer guéri PDMS-couverte maîtres du four. </li><li> Couper les dispositifs individuels des maîtres (chaque maître contient trois appareils identiques) et de se décoller. </li><li> Enlever la colle des régions d&#39;entrée à l&#39;aide d&#39;une aiguille ou une paire de pinces. </li><li> Prenez le contrôle de la couche de PDMS dans la salle blanche. </li></ol> Mince fabrication des membranes en PDMS <ol><li> Comme le montre le principe de l&#39;appareil, la couche intermédiaire se compose d&#39;un ~ 12 um d&#39;épaisseur membrane de PDMS. </li><li> Mélanger 10:01 poids. ratio de PDMS prépolymère / mélange durcisseur avec de l&#39;hexane (3:1 en poids. ratio) par vortex. </li><li> Déplacer dans une salle blanche. (Un environnement sans poussière est essentielle pour assurer que les membranes en PDMS sont exempts de défauts; particules de poussière peut entraîner des membranes contenant des trous et / ou mal lié à la moisissure réplique.) </li><li> Mettez un silanisé 3 pouces de diamètre sur la plaquettele mandrin à vide d&#39;un spinner Solitec. La plaquette doit être silanisé (dérivatisés avec fluorosilane) avant de filer PDMS afin de faciliter la libération de PDMS à partir des surfaces de silicium. Le bol en téflon extérieur du mandrin était enveloppé d&#39;un film plastique pour un nettoyage facile. </li><li> Distribuer 2-3 ml de PDMS / Hexane mélange sur la plaquette en utilisant une aiguille de la seringue de calibre 18 (pour minimiser les bulles). </li><li> Définissez les paramètres spin. Centrifuger à 7000 rpm pendant 30 sec, résultant en un film de PDMS d&#39;épaisseur ~ um 12. </li><li> Chauffer la plaquette à 85 ° C pendant 4 min sur une plaque chauffante pour guérir le film de PDMS. </li></ol> Multicouche de collage et l&#39;assemblage dispositif de PDMS <ol><li> Mettez la couche de contrôle et de la membrane de PDMS dans une chambre de plasma d&#39;oxygène. Tourner sur le plasma pendant 30 sec (pression d&#39;oxygène de 30 psi, le débit de 3 à 5 SCFH, 550W). Apportez la couche de contrôle en contact avec la membrane de PDMS immédiatement (dans les 5 minutes) après activation de l&#39;oxygène. Les paramètres du système, tels que la pression d&#39;oxygène, le débit et la puissance du plasma et du temps de traitement, sont empiriquement configuré selon les différentes applications. </li><li> Attendre 5 min, puis retirez la couche de contrôle de la plaquette avec la membrane. </li><li> Retirer les membranes sur les domaines afin que les deux entrées de commande et les couches fluides sont accessibles par le haut via un tube. </li><li> Aligner la couche de contrôle (avec tubes comme entrées) avec la couche fluidiques (planar) sous un stéréoscope. Parce que les joints PDMS sur le PDMS, pas de liaison permanente est requise. </li></ol> Contrôlé par ordinateur d&#39;ouverture et de clôture de microvannes PDMS par vide ou sous pression <ol><li> Après l&#39;alignement de périphérique et de montage, insérez 1 / 16 po OD (ID pouces 1 / 32) tuyau Tygon dans les criques 1,14 mm ID de silicone et de connecter les entrées aux sources de pression ou les réservoirs fluidiques. </li><li> Pour ouvrir et fermer les vannes, les pressions sont contrôlés par une ligne de vide et d&#39;une ligne de pression d&#39;air relié par deux régulateurs de pression à un tableau de miniatures électrovannes à trois voies. </li><li> Les électrovannes sont raccordées au National Instruments matériel d&#39;acquisition de données via le logiciel Labview. </li><li> Fonctionnement de l&#39;appareil et la déviation de membrane sont visualisés avec une caméra CCD couleur (SPOT RT, instruments de diagnostic, Sterling Heights, Michigan). </li></ol> Parallèlement mélange de deux colorants de couleurs différentes dans les différents volumes définis nanolitre Nous démontrons l&#39;opération d&#39;un mélangeur en parallèle qui permet de stocker et de mélange précis des sous-nanolitre volumes de solutions aqueuses à différents rapports de mélange: <ol><li> La couche fluidiques contient deux tableaux de microchambres: En tableau A, la taille de la microchambres diminue, à partir de la gauche, à partir de 200 um x 400 um à 200 um x 40 um; A 10 est une chambre de 500 um um x 40 et est utilisé seulement pour connexion fluidique dans Array; à droite de la chambre A 10 est un ensemble de chambres symétriquement croissante dans les tailles. Les chambres en B array sont conçus de telle sorte que le volume ajouté de deux chambres voisines dans des lignes différentes toujours égale à. A 0, A et B 10r 0r 10, B sont conçus comme des témoins respectifs des solutions A et B sans se mélanger. </li><li> La couche de contrôle dispose de deux ensembles de manière indépendante contrôlée par des vannes. Un jeu de vannes V {1} est utilisé pour connecter deux tableaux de chambre avec leurs entrées respectives, tandis qu&#39;une deuxième série de vannes V {2} est utilisé pour connecter chaque paire de chambres dans les deux tableaux. </li><li> Remplissez le microchambres en ouvrant set robinet {1} V pour permettre l&#39;écoulement de deux solutions de colorants à des tableaux A et B, respectivement. Flux des solutions peut être réalisé soit en mains propres ou par le vide en tirant contrôlé avec électrovannes. Si des bulles d&#39;air se forment dans l&#39;microchambres, plus de solution peut être poussé pour éliminer les bulles, ou l&#39;appareil peut être laissé pour quelques minutes et les bulles vont disparaître en raison de la perméabilité à l&#39;air de PDMS. </li><li> Fermez le robinet ensemble {1} V pour isoler chaque chambre dans les deux tableaux. </li><li> Set robinet ouvert {2} V pour permettre au fluide de mélange entre les chambres adjacentes dans des tableaux différents. Le mélange ne prend ~ 1-2 min à remplir pour ces volumes. </li><li> Fermer {2} V pour pousser le fluide vers chaque chambre fluidique et chambres déforment à leur forme originale. Comme les deux tableaux fluidiques sont conçus avec des chambres de différentes tailles 11, 11 différents rapports de mélange sont produits en une seule étape de mélange. </li></ol> Un système intégré pour la microfluidique contrôlée par ordinateur perfusion de cultures de cellules microfluidique Nous démontrons un système microfluidique qui est capable de la perfusion automatisée de multiples solutions pour une chambre de culture cellulaire unique. L&#39;entrées sont contrôlées par des microvannes, qui peut être activé dans toute séquence d&#39;entrées simples, des combinaisons différentes, ou tous à la fois. L&#39;appareil est capable de produire des gradients ou des mélanges des différentes solutions. Cet appareil se compose également de trois couches: une couche fluidique, une couche de contrôle, et un milieu fine membrane de PDMS. Étapes de fabrication de rechange pour cet appareil: <ol><li> Les orifices d&#39;entrée pour les canaux fluidiques et les canaux de contrôle sont «coup de poing&quot; en utilisant un diamètre 1,2 mm Harris Micro-Punch (Ted Pella, Inc.) Les tubes sont reliés aux entrées en utilisant des aiguilles de calibre 18 émoussées qui sont insérés dans le PDMS à travers la couche de contrôle. Cela permet un emballage plus dense de criques que les tubes en silicone. La conformité du PDMS fournit un joint étanche autour des aiguilles d&#39;exécuter efficacement fluide ou pression pneumatique. </li><li> Comme décrit précédemment, le collage de la fine membrane de PDMS à la couche de contrôle est accompli en utilisant l&#39;exposition au plasma d&#39;oxygène. </li><li> La couche fluidique est préparé par moulage réplique avec PDMS pré-polymère et cross-linker à un ratio de 5:1 et partiellement cure pendant 25 minutes à 60 ° C dans un four à convection. À ce stade, la couche partiellement guérie fluidique est encore collante, et pourtant il peut être retiré de la maîtriser. </li><li> La couche fluidique est aligné manuellement au contrôle pré-assemblés et couches de la membrane à l&#39;aide d&#39;un stéréoscope. Le dispositif assemblé est ensuite placé sur une plaque chauffante pendant 5 minutes à 80 º C. Ensuite, les lignes de commande de soupapes sont connectés au contrôleur automatisé et les soupapes sont actionnées jusqu&#39;à ce que la membrane se détache de la couche fluidiques à tous les sièges de soupapes en appliquant un vide. Après &quot;détacher&quot; les vannes, le contrôleur ordinateur est configuré pour le cycle des vannes sur et en dehors tandis que le dispositif est encore guéri sur la plaque chauffante à 80 º C pendant au moins 1 heure. </li></ol> Les caractéristiques de notre système microfluidique intégré: L&#39;appareil est capable de perfusion automatisée de 16 solutions différentes à une chambre de culture cellulaire en utilisant un schéma valves multiplexés. La conception de canal assure que la résistance de l&#39;ensemble des entrées est équilibré. Notre conception microvanne isole des solutions et des commandes de rinçage par des canaux intégré pour l&#39;élimination rapide de liquide, ce qui limite la contamination croisée. Un mixeur intégré à chevrons peut être activé pour produire des mélanges de différentes entrées. De plus, il ya quatre canaux résistance variant qui peut être activé pour modifier le débit.

<ol>
	<li>Li, N., Hsu, C. H., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+mixing+of+photolithographically-defined+nanoliter+volumes+using+elastomeric+microvalve+arrays.">Parallel mixing of photolithographically-defined nanoliter volumes using elastomeric microvalve arrays.</a> Electrophoresis. 26 (19), 3858-3864 (2005).</li><li>Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+large-scale+integration.">Microfluidic large-scale integration.</a> Science. 298 (5593), 580-584 (2002).</li></ol>

Principaux avantages de notre conception microvanne: <ol><li> Aucune source d&#39;énergie supplémentaire est nécessaire pour fermer le chemin fluidique, où le dispositif de chargement est très portable, et </li><li> L&#39;appareil peut être construit par des répliques du PDMS photolithographie à motifs SU-8 moules, permettant microfabricating profond (jusqu&#39;à 1 mm) canaux à parois latérales verticales (c&#39;est à dire la hauteur des caractéristiques peuvent être spécifiées indépendamment de leur largeur) et résult...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Clean silicon wafers</td>
<td>Supplies</td>
<td>Silicon Sense Inc.</td>
<td>3P0110TEST</td>
<td>3-inch diameter, P/Boron</td>
</tr>
<tr>
<td>"Master" wafers containing SU-8 patterns</td>
<td>Supplies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fabricated in house using standard photolithography procedures </td>
</tr>
<tr>
<td>Desiccators (2)</td>
<td>Equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>24987-048</td>
<td>One for silanization, one for PDMS de-bubbling.</td>
</tr>
<tr>
<td>Balance</td>
<td>Equipment</td>
<td>OHAUS Corp.</td>
<td>SC6010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oven</td>
<td>Equipment</td>
<td>Sheldon Mfg. Inc.</td>
<td>1330GM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MiniVortexer</td>
<td>Equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>58816-121</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spinner</td>
<td>Equipment</td>
<td>Headway Research Inc.</td>
<td>PWM32</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plasma etcher</td>
<td>Equipment</td>
<td>Plasmatic Systems Inc. </td>
<td>Plasma Preen II-973</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hot Plate</td>
<td>Equipment</td>
<td>Torre Pines Scientific</td>
<td>HP30A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stereoscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>Nikon</td>
<td>TMZ1500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CCD camera</td>
<td>Equipment</td>
<td>Diagnostic Instruments</td>
<td>SPOT RT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Solenoid valves</td>
<td>Equipment</td>
<td>Lee Company</td>
<td>LHDA0511111H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Data acquisition board</td>
<td>Hardware</td>
<td>National Instruments</td>
<td>PCI 6025E, CB-50LP</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LabView</td>
<td>Software</td>
<td>National Instruments</td>
<td>Version 8.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tridecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane</td>
<td>Reagent</td>
<td>United Chemical Technologies</td>
<td>T2492</td>
<td>Silanization must be done in a chemical fume hood.</td>
</tr>
<tr>
<td>PDMS prepolymer and crosslinker</td>
<td>Reagent</td>
<td>Dow-Corning</td>
<td>Sylgard 184</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hexane</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD	</td>
<td>HX0295-6	</td>
<td>

</td>
</tr>
<tr>
<td>Color Dyes</td>
<td>Reagent</td>
<td>Spectrum Chemical Mfg. Corp.</td>
<td>FD&C 110, 135, 150</td>
<td>Blue #1, Yellow #5, Red #3. 
</td>
</tr>
<tr>
<td>3 ml disposable transfer pipets</td>
<td>Supplies</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-711-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Kimwipes</td>
<td>Supplies</td>
<td>Kimberly-Clark</td>
<td>34155</td>
<td>



</td>
</tr>
<tr>
<td>Weighing boats</td>
<td>Supplies</td>
<td>VWR </td>
<td>12577-027</td>
<td>




</td>
</tr>
<tr>
<td>Tongue depressor</td>
<td>Supplies	</td>
<td>Fisher Scientific	</td>
<td>11-700-555	</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P100 dishes</td>
<td>Supplies</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-772E</td>
<td>		</td>
</tr>
<tr>
<td>Silicone tubing (1.14 mm inner diameter (I.D.))</td>
<td>Supplies	</td>
<td>Cole-Palmer Instrument Co.</td>
<td>07625-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tygon tubing (O.D. 1/16 in; I.D. 1/32 in)</td>
<td>Supplies	</td>
<td>Cole-Palmer Instrument Co.	</td>
<td>06418-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Duco Cement</td>
<td>Supplies</td>
<td>Devcon</td>
<td>6245</td>
<td>



</td>
</tr>
<tr>
<td>Razor blade</td>
<td>Tools</td>
<td>VWR</td>
<td>55411-050</td>
<td>



</td>
</tr>
<tr>
<td>Needles</td>
<td>Tools</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>0053482 (25 Gauge)</td>
<td>




</td>
</tr>
<tr>
<td>#5 Forceps</td>
<td>Tools</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11251-20</td>
<td>



</td>
</tr>
<tr>
<td>50 ml centrifuge tube</td>
<td>Supplies</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>05-526B</td>
<td>




</td>
</tr>
<tr>
<td>Seal wrap film</td>
<td>Supplies	</td>
<td>AEP Industries Inc.	</td>
<td>0153877</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
<td>Supplies</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>05-406-16</td>
<td>




</td>
</tr>
<tr>
<td>15 ml centrifuge tubes	</td>
<td>Supplies	</td>
<td>BD Falcon	</td>
<td>352097</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Purple nitrile power-free gloves</td>
<td>Supplies 	</td>
<td>VWR 	</td>
<td>40101-348</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.2 mm Harris biopsy punch	</td>
<td>Tools</td>
<td>Ted Pella, Inc.</td>
<td>15074	</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

microfluidic chips controlled with elastomeric microvalve arrays

Miniaturisés systèmes microfluidiques fournir des solutions simples et efficaces à faible coût en points-of-care diagnostic et tests à haut débit biomédicale. Contrôle de flux robuste et précis des volumes fluidiques sont deux exigences essentielles pour ces applications. Nous avons développé les puces microfluidiques avec élastomère polydiméthylsiloxane (PDMS) tableaux microvanne que: 1) n&#39;ont pas besoin de source d&#39;énergie supplémentaire pour fermer le chemin fluidique, où le dispositif de chargement est très portable, et 2) permettent de microfabricating profond (jusqu&#39;à 1 mm) canaux avec des flancs verticaux et résultant en des caractéristiques très précises. Le PDMS microvannes à base de dispositifs constitués de trois couches: une couche contenant des chemins fluidiques fluidique et microchambres de différentes tailles, une couche de contrôle contenant des microcanaux nécessaire pour actionner le chemin fluidique avec microvannes, et un milieu fine membrane de PDMS qui est lié à la commande couche. Couche et les couches de contrôle fluidique sont réalisés par moulage réplique de PDMS de SU-8 maîtres résine photosensible, et la fine membrane de PDMS est faite par filature PDMS à des hauteurs spécifiées. La couche de contrôle est lié à la fine membrane de PDMS, après activation de l&#39;oxygène à la fois, et ensuite assemblés avec la couche fluidiques. Les microvannes sont fermés au repos et peut être ouvert par l&#39;application d&#39;une pression négative (par exemple, le vide maison). La fermeture et l&#39;ouverture sont microvanne automatisé via électrovannes commandées par un logiciel informatique. Ici, nous démontrer deux microvanne basée sur les puces microfluidiques pour deux applications différentes. La première puce permet de stocker et de mélange précis des sous-nanolitre volumes de solutions aqueuses à différents rapports de mélange. La seconde puce permet contrôlé par ordinateur perfusion de cultures de cellules microfluidique. Les appareils sont faciles à fabriquer et facile à contrôler. En raison de la biocompatibilité des PDMS, ces puces pourraient avoir de vastes applications dans des tests de diagnostic miniaturisés ainsi que les études de base en biologie cellulaire.

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Microfluidic Chips Controlled with Elastomeric Microvalve Arrays

Nous démontrons protocoles pour la fabrication et l&#39;automatisation des élastomères polydiméthylsiloxane (PDMS) des tableaux basés sur microvanne qui n&#39;ont pas besoin d&#39;énergie supplémentaire de fermer et de fonctionnalité de photolithographie définie volumes précis. Un parallèle subnanoliter-volume du mélangeur et d&#39;un système de perfusion intégré microfluidique sont présentés.

Puces microfluidiques contrôlée avec les tableaux microvanne élastomère

Miniaturized microfluidic systems provide simple and effective solutions for low-cost point-of-care diagnostics and high-throughput biomedical assays.  ...

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Research

JoVE Journal

Biology

20.9K vues.  University of Washington. Nous démontrons protocoles pour la fabrication et l'automatisation des élastomères polydiméthylsiloxane (PDMS) des tableaux basés sur microvanne qui n'ont pas besoin d'énergie supplémentaire de fermer et de fonctionnalité de photolithographie définie volumes précis. Un parallèle subnanoliter-volume du mélangeur et d'un système de perfusion intégré microfluidique sont présentés.

Vidéo: Microfluidic Chips Controlled with Elastomeric Microvalve Arrays

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Un dispositif microfluidique avec des modèles Groove pour étudier le comportement cellulaire

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Recherche

Biologie

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

Un dispositif microfluidique Dégradé génératrices de biologie cellulaire

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Cell Capture Using a Microfluidic Device

Capturez cellule à l&#39;aide d&#39;un dispositif microfluidique

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In our lab, we have successfully isolated nucleic acids directly from microliter and submicroliter volumes of human blood, urine and stool using polymer/nanoparticle composite microscale lysis and solid phase extraction columns. The recovered samples are concentrated, small volume samples that are PCRable, without any additional cleanup. Here, we demonstrate how to fabricate thermoplastic microfluidic chips using hot embossing and heat sealing. Then, we demonstrate how to use in situ light directed surface grafting and polymerization through the sealed chip to form the composite solid phase columns. We demonstrate grafting and polymerization of a carbon nanotube/polymer composite column for bacterial cell lysis. We then show the lysis process followed by solid phase extraction of nucleic acids from the sample on chip using a silica/polymer composite column. The attached protocols contain detailed instructions on how to make both lysis and solid phase extraction columns.

Here we demonstrate how to fabricate thermoplastic microfluidic chips using hot embossing and heat sealing. Then we demonstrate how to use in situ light directed surface grafting and polymerization through the sealed chip to form the composite solid phase columns.

La fabrication des canaux microfluidiques thermoplastique

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In this interview, Dr. Klapperich discusses the fabrication of thermoplastic microfluidic devices and their application for development of new diagnostics.

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Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

La cartographie des réseaux fonctionnels bactériens et voies de<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; En utilisant des tableaux synthétiques génétiques

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is constrained by limiting specific nutrients.1,2 Data from chemostats are highly reproducible for the measurement of quantitative phenotypes as they provide a constant growth rate and environment at steady state. For these reasons, chemostats have become useful tools for fine-scale characterization of physiology through analysis of gene expression3-6 and other characteristics of cultures at steady-state equilibrium.7 Long-term experiments in chemostats can highlight specific trajectories that microbial populations adopt during adaptive evolution in a controlled environment. In fact, chemostats have been used for experimental evolution since their invention.8 A common result in evolution experiments is for each biological replicate to acquire a unique repertoire of mutations.9-13 This diversity suggests that there is much left to be discovered by performing evolution experiments with far greater throughput. 
We present here the design and operation of a relatively simple, low cost array of miniature chemostats&mdash;or ministats&mdash;and validate their use in determination of physiology and in evolution experiments with yeast. This approach entails growth of tens of chemostats run off a single multiplexed peristaltic pump. The cultures are maintained at a 20 ml working volume, which is practical for a variety of applications. It is our hope that increasing throughput, decreasing expense, and providing detailed building and operation instructions may also motivate research and industrial application of this design as a general platform for functionally characterizing large numbers of strains, species, and growth parameters, as well as genetic or drug libraries.

We developed and validated a small-footprint array of miniature chemostats built from readily available parts for low cost. Physiological and experimental evolution results were similar to larger volume chemostats. The ministat array provides a compact, inexpensive, and accessible platform for traditional chemostat experiments, functional genomics, and chemical screening applications.

Conception et utilisation des tableaux chémostat multiplexés

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is ...

Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two ways: purification from in vivo sources, or reconstitution in vitro from recombinant core histones and tandemly repeated nucleosome positioning DNA. The latter method has the benefit of allowing for the assembly of a more compositionally uniform and precisely positioned nucleosomal array. Sedimentation velocity experiments in the analytical ultracentrifuge yield information about the size and shape of macromolecules by analyzing the rate at which they migrate through solution under centrifugal force. This technique, along with atomic force microscopy, can be used for quality control, ensuring that the majority of DNA templates are saturated with nucleosomes after reconstitution. Here we describe the protocols necessary to reconstitute milligram quantities of length and compositionally defined nucleosomal arrays suitable for biochemical and biophysical studies of chromatin structure and function.

A method is presented for the reconstitution of model nucleosomal arrays from recombinant core histones and tandemly repeated nucleosome positioning DNA. We also describe how sedimentation velocity experiments in the analytical ultracentrifuge, and atomic force microscopy (AFM) are used to monitor the extent of nucleosomal array saturation after reconstitution.

Assemblée des nucléosomiques tableaux de recombinants base histones et nucléosomes ADN positionnement

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule  are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two  ...

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that exhibit partial and variable transmission rates of extrachromosomal arrays to the next generation. In addition, transgenic animals are mosaic and express the transgene in a variable number of cells. Extrachromosomal arrays can be integrated into the C. elegans genome using UV irradiation to establish nonmosaic transgenic strains with 100% transmission rate of the transgene. To that extent, F1 progenies of UV irradiated transgenic animals are screened for animals carrying a heterozygous integration of the transgene, which leads to a 75% Mendelian transmission rate to the F2 progeny. One of the challenges of this method is to distinguish between the percentage of transgene transmission in a population before (X% transgenic animals) and after integration (&#8805;75% transgenic F2 animals). Thus, this method requires choosing a nonintegrated transgenic line with a percentage of transgenic animals that is significantly lower than the Mendelian segregation of 75%. Consequently, nonintegrated transgenic lines with an extrachromosomal array transmission rate to the next generation &#8804;60% are usually preferred for integration, and transgene integration in highly transmitting strains is difficult. Here we show that the efficiency of extrachromosomal arrays integration into the genome is increased when using highly transmitting transgenic lines (&#8805;80%). The described protocol allows for easy selection of several independent lines with homozygous transgene integration into the genome after UV irradiation of transgenic worms exhibiting a high rate of extrachromosomal array transmission. Furthermore, this method is quite fast and low material consuming. The possibility of rapidly generating different lines that express a particular integrated transgene is of great interest for studies focusing on gene expression pattern and regulation, protein localization, and overexpression, as well as for the development of subcellular markers.

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

This protocol describes a rapid and low material consuming procedure for the integration of transgenic extrachromosomal arrays into the Caenorhabditis elegans genome using ultra violet (UV) irradiation. Furthermore, this protocol is particularly well suited for transgenic lines that transmit extrachromosomal arrays at a high rate.

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

Identifier les sites d&#39;interaction protéine-protéine à l&#39;aide de peptides tableaux

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...