Ce test à haut débit peut être utilisé pour observer un comportement gravitactique robuste chez les larves de caenorhabditis dauer. Le comportement des vers est observé sur de grandes distances par rapport aux essais effectués sur une boîte de Pétri. Cela améliore la sensibilité du test et permet une analyse détaillée des données.
L’étude du comportement de la gravitaxie peut donner un aperçu de la façon dont la sensation de gravité se produit dans la cénorhabdite, ce qui est pertinent pour comprendre le système vestibulaire des mammifères. Créer les chambres d’essai gravitaxies, isoler les dauers et injecter les vers dans les chambres demande de la pratique. Vous pouvez gagner du temps en isolant les dauers et en créant les chambres un jour à l’avance.
Commencez par installer un brûleur Bunsen, une à deux lames de rasoir, une pince, une pince à épiler, une surface de coupe en plastique et une hotte anti-fumée. Pour faire une chambre, rassemblez deux pipettes sérologiques de 5 millilitres et, avec une pince à épiler, retirez le bouchon de coton d’une pipette. Tenez une lame de rasoir à l’aide d’une pince sur le brûleur Bunsen jusqu’à ce qu’il soit chaud.
Utilisez la lame chauffée pour trancher l’extrémité effilée de la deuxième pipette afin que la pipette entière ait un diamètre uniforme. Maintenant, rapprochez rapidement les deux extrémités de pipette modifiées de la flamme et faites-les fondre légèrement. Joignez ces extrémités en les pressant fermement, en veillant à ce que les parois des deux pipettes soient continues.
Si des espaces sont visibles après la jonction, séparez-les et répétez cette étape. Préparer NGM avec 4% de gélose selon les procédures standard de vers et remplir chaque chambre en l’attachant à un pipetter sérologique pendant que la gélose est encore fondue. Pour minimiser les variations de la consistance de la gélose dues à un refroidissement inégal, maintenez la pipette parallèle au dessus de la paillasse tout en tirant la gélose
Ensuite, aspirez lentement la solution et scellez l’embout avec du parafilm avant de retirer la chambre de la pipette. Posez la chambre à plat pour refroidir et laissez la gélose durcir avant de la déplacer. Une fois refroidi, chauffez une clé hexagonale de trois millimètres sur un brûleur Bunsen et créez une petite ouverture en plastique en la pressant fermement dans la paroi de chaque chambre à environ cinq millimètres d’un côté de la ligne médiane.
Ensuite, utilisez une lame chauffante pour enlever le coton et les extrémités effilées de la chambre et scellez les extrémités avec un film de paraffine. 10 à 15 jours avant l’expérience, coupez chaque souche sur deux à trois grandes plaques NGM avec des bactéries OP50 et enveloppez le film de paraffine. Recueillir les vers en rinçant les couvercles et les plaques avec M9 Buffer et en pipetant la solution dans des tubes à centrifuger de 15 millilitres.
Ensemencer les vers en les faisant tourner à 1600 x G pendant 30 à 60 secondes à température ambiante et aspirer la majeure partie du tampon M9 à l’aide d’une pipette ou d’un aspirateur à vide. Ajouter sept millilitres de solution de dodécylsulfate de sodium à 1% à chaque pastille de ver et laisser les vers dedans pendant 30 minutes. Pour permettre l’aération, continuez à faire tourner les tubes en continu pendant ce temps.
Ensuite, retirez le détergent en le rinçant trois à cinq fois avec du M9. Après avoir ajouté cinq millilitres M9, ajoutez cinq millilitres de solution de saccharose à 60% filtrée à froid. Bien mélanger et créer un gradient de séparation en centrifugeant à 1600 x G pendant cinq minutes à température ambiante. Remplissez les nouveaux tubes centrifuges de 15 millilitres avec deux millilitres de tampon M9.
Maintenant, écrasez les extrémités des pipettes Pasteur en verre pour élargir l’alésage. Et utilisez ces pipettes pour transférer la couche supérieure de la solution du gradient de saccharose aux nouveaux tubes. Rincez les dauers trois à cinq fois avec M9 Buffer.
Centrifuger les baraudes à 1600 x G pendant cinq minutes à température ambiante et aspirer la majeure partie de la solution M9 à l’aide d’une pipette ou d’un aspirateur à vide. Ensuite, estimez la densité des vers en comptant manuellement le nombre de vers dans trois gouttelettes distinctes de 1 microlitre sous un microscope à dissection, et utilisez la moyenne de ces comptes pour estimer le nombre de vers par microlitre. Maintenant, élargissez l’alésage de la pointe en coupant l’extrémité des pointes de pipette de 10, 20 ou 200 microlitres.
Réglez la micropipette à un volume légèrement supérieur au volume d’aspiration prévu. Aspirez environ 1 à 2 microlitres de la solution de ver concentrée et laissez entrer une petite quantité d’air dans la pointe. Poussez doucement l’embout de la pipette dans la gélose tout en appuyant sur la micro-pipette.
Cela créera un site d’injection sans obstruer la pointe. Relâchez les vers dans la gélose et utilisez un film de paraffine pour sceller l’ouverture. Pour éliminer autant de variables que possible une fois que les chambres sont placées dans une cage de Faraday sombre à température ambiante, étiquetez chaque chambre et suspendez-la verticalement dans la cage de Faraday.
Testez simultanément les contrôles horizontaux en posant certaines chambres à plat dans les mêmes conditions environnementales. Utilisez ensuite les vers N2 orientés verticalement comme témoin positif et les chambres orientées horizontalement contenant des dauers N2 comme contrôle négatif supplémentaire contre les souches expérimentales. Après quelques heures, les vers dauer commencent à se disperser à partir du site de départ et mettent plusieurs heures à atteindre chaque extrémité de la chambre.
Laissez les chambres intactes pendant ce temps et notez dans les 12 à 24 heures suivant l’injection. Ensuite, retirez les chambres une à la fois et marquez l’axe de gravité en recherchant des dauers vivants sous un microscope à dissection et en marquant leurs emplacements avec de l’encre. Ne marquez pas les vers à moins de 2,5 centimètres de chaque côté du site d’injection, car il est peu probable que ces vers présentent une préférence directionnelle.
En outre, évitez de marquer les vers qui semblent morts ou qui sont piégés dans le liquide et jetez toutes les chambres contenant plus de 50% de vers morts ou nageurs. Pour quantifier les résultats, utilisez un marqueur pour diviser chaque moitié de la chambre en sept de 3,5 centimètres, à partir de 2,5 centimètres du site d’injection. Utilisez un compteur de comptage manuel pour compter le nombre de vers observés dans chaque section.
Chez Caenorhabditis briggsae, un grand pourcentage de vers dauer ont montré une migration vers le haut des chambres. Cependant, les contrôles horizontaux ont montré une distribution autour du centre des chambres, indiquant un comportement gravitactique négatif. En outre, les distributions verticales de caenorhabditis briggsae et caenorhabditis elegans n’ont montré aucune différence, ce qui suggère que caenorhabditis briggsae dauers montre un comportement gravitationnel négatif similaire à celui de caenorhabditis elegans dauers.
Les agents paralytiques tels que l’azoture de sodium ne sont pas utilisés dans ce protocole. Par conséquent, il est important de noter les chambres de gravité dès qu’elles sont retirées de la cage de Faraday. Ce test a conduit à la découverte d’un comportement gravitationnel négatif chez c. elegans.
En testant plusieurs souches mutantes, il a également révélé des besoins génétiques et neuronaux pour la gravitaxie chez les vers.
