Este ensayo de alto rendimiento se puede utilizar para observar un comportamiento gravitáctico robusto en larvas de caenorhabditis dauer. El comportamiento del gusano se observa a grandes distancias en comparación con los ensayos realizados en una placa de Petri. Esto mejora la sensibilidad del ensayo y permite un análisis detallado de los datos.
El estudio del comportamiento del eje gravitacional puede proporcionar información sobre cómo se produce la sensación de gravedad en la caenorhabditis, que tiene relevancia para comprender el sistema vestibular de los mamíferos. Crear las cámaras de ensayo del eje gravitativo, aislar a los dauers e inyectar los gusanos en las cámaras requiere práctica. Puede ahorrar tiempo aislando los dauers y creando las cámaras con un día de anticipación.
Comience instalando un mechero Bunsen, una o dos cuchillas de afeitar, alicates, pinzas y una superficie de corte de plástico, y una campana extractora. Para hacer una cámara, reúna dos pipetas serológicas de 5 mililitros y, con pinzas, retire el tapón de algodón de una pipeta. Sostenga una hoja de afeitar con unos alicates sobre el mechero Bunsen hasta que esté caliente.
Utilice la cuchilla calentada para cortar el extremo cónico de la segunda pipeta de modo que toda la pipeta tenga un diámetro uniforme. Ahora, acerque rápidamente los dos extremos de pipeta modificados a la llama y derrítalos ligeramente. Une estos extremos presionándolos firmemente, asegurándote de que las paredes de ambas pipetas sean continuas.
Si hay huecos visibles después de unirse, sepárelos y repita este paso. Prepare NGM con agar al 4% de acuerdo con los procedimientos estándar de gusanos y llene cada cámara uniéndolo a un pipeteo serológico mientras el agar aún está fundido. Para minimizar cualquier variación en la consistencia del agar debido a un enfriamiento desigual, sostenga el pipeteo paralelo a la parte superior del banco mientras dibuja el agar.
Luego, extraiga lentamente la solución y selle la punta con parafilm antes de retirar la cámara del pipeteo. Coloque la cámara plana para que se enfríe y permita que el agar se endurezca antes de moverse. Una vez enfriado, caliente una llave hexagonal de tres milímetros sobre un mechero Bunsen y cree una pequeña abertura de plástico presionándola firmemente contra la pared de cada cámara a unos cinco milímetros a un lado de la línea media.
A continuación, use una cuchilla calentada para quitar el algodón y los extremos cónicos de la cámara y selle los extremos con una película de parafina. De 10 a 15 días antes del experimento, divida cada cepa en dos o tres placas NGM grandes con bacterias OP50 y envuelva la película de parafina. Recoja los gusanos enjuagando las tapas y placas con M9 Buffer y pipeteando la solución en tubos de centrífuga de 15 mililitros.
Granular los gusanos girando a 1600 x G durante 30 a 60 segundos a temperatura ambiente y aspirar la mayor parte del tampón M9 con una pipeta o aspirador de vacío. Agregue siete mililitros de solución de dodecil sulfato de sodio al 1% a cada gránulo de gusano y deje los gusanos en él durante 30 minutos. Para permitir la aireación, siga girando los tubos continuamente durante este tiempo.
Luego, retire el detergente enjuagándolo de tres a cinco veces con M9. Después de agregar cinco mililitros M9, agregue cinco mililitros de solución de sacarosa al 60% filtrada en frío. Mezclar bien y crear un gradiente de separación centrifugando a 1600 x G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Llene los nuevos tubos de centrífuga de 15 mililitros con dos mililitros de M9 Buffer.
Ahora aplaste los extremos de las pipetas de vidrio Pasteur para ensanchar el orificio. Y use estas pipetas para transferir la capa superior de la solución del gradiente de sacarosa a los nuevos tubos. Enjuague los dauers de tres a cinco veces con M9 Buffer.
Centrífuga a 1600 x G durante cinco minutos a temperatura ambiente y aspirar la mayor parte de la solución M9 con una pipeta o aspirador de vacío. A continuación, calcule la densidad de gusanos contando manualmente el número de gusanos en tres gotas separadas de 1 microlitro bajo un microscopio de disección, y use el promedio de estos recuentos para aproximar el número de gusanos por microlitro. Ahora amplíe el orificio de la punta cortando el extremo de las puntas de pipeta de 10, 20 o 200 microlitros.
Ajuste la micropipeta a un volumen ligeramente mayor que el volumen de aspiración previsto. Aspire aproximadamente de 1 a 2 microlitros de la solución de gusano concentrada y permita que entre una pequeña cantidad de aire en la punta. Empuje suavemente la punta de la pipeta en el agar mientras presiona la micropipeta.
Esto creará un sitio de inyección sin obstruir la punta. Suelte los gusanos en el agar y use una película de parafina para sellar la abertura. Para eliminar tantas variables como sea posible una vez que las cámaras se colocan dentro de una jaula oscura de Faraday a temperatura ambiente, etiquete cada cámara y cuélguela verticalmente dentro de la jaula de Faraday.
Pruebe los controles horizontales simultáneamente colocando algunas cámaras planas dentro de las mismas condiciones ambientales. Luego use los gusanos N2 orientados verticalmente como control positivo y las cámaras orientadas horizontalmente que contienen dauers N2 como un control negativo adicional contra las cepas experimentales. Después de unas horas, los gusanos dauer comienzan a dispersarse desde el sitio de inicio y tardan varias horas en llegar a cada extremo de la cámara.
Deje las cámaras sin ser molestadas durante este tiempo y marque dentro de las 12 a 24 horas posteriores a la inyección. A continuación, retire las cámaras una a la vez y marque el eje gravitacional buscando dauers vivos bajo un microscopio de disección y marcando sus ubicaciones con tinta. No marque los gusanos dentro de los 2,5 centímetros a cada lado del sitio de inyección, ya que es probable que estos gusanos no demuestren una preferencia direccional.
Además, evite marcar gusanos que parezcan muertos o estén atrapados en el líquido y deseche cualquier cámara que contenga más del 50% de gusanos muertos o nadadores. Para cuantificar los resultados, use un marcador para dividir cada mitad de la cámara en siete de 3,5 centímetros, comenzando a 2,5 centímetros del lugar de inyección. Utilice un contador de conteo manual para contar el número de gusanos observados en cada sección.
En caenorhabditis briggsae, un gran porcentaje de gusanos dauer mostraron migración hacia la parte superior de las cámaras. Sin embargo, los controles horizontales mostraron distribución alrededor del centro de las cámaras, lo que indica un comportamiento gravitáctico negativo. Además, las distribuciones verticales de caenorhabditis briggsae y caenorhabditis elegans no mostraron ninguna diferencia, lo que sugiere que los dauers de caenorhabditis briggsae muestran un comportamiento gravitaxis negativo similar al de caenorhabditis elegans dauers.
Los agentes paralíticos como la azida de sodio no se utilizan en este protocolo. Por lo tanto, es importante marcar las cámaras del eje gravitacional tan pronto como se retiren de la jaula de Faraday. Este ensayo condujo al descubrimiento del comportamiento negativo del eje gravitacional en c.elegans.
A través de pruebas de varias cepas mutantes, también reveló requisitos genéticos y neuronales para el eje gravitacional en gusanos.
