Ce protocole peut aider à comprendre les mécanismes impliqués dans la régulation de KCC2 en évaluant directement sa phosphorylation de taille moléculaire kinase, mettant ainsi en lumière ses fonctions et activités physiologiques. Il peut être utilisé pour identifier et caractériser des molécules comme des protéines d’intérêt à partir de mélanges complexes de molécules apparentées, même lorsqu’une expression protéique est très infime. La technique est un outil essentiel pour l’analyse des protéines de systèmes complexes et l’identification des mécanismes potentiels sous-jacents à la fonction tissulaire aberrante ou à la maladie.
La démonstration des procédures sera Sunday Solomon Josiah, un doctorant de mon laboratoire. Commencez par préarmer tous les réactifs dans le bain de perles de 37 degrés Celsius et décongelez complètement les cellules embryonnaires de rein humain KCC2b du rat KCC2b dans le bain de perles. Ensuite, transférez les cellules du tube cryo dans un tube centrifuge contenant cinq millilitres de milieu frais et centrifugez les cellules à 1 200 G pendant trois à cinq minutes.
Après avoir aspiré le surnageant à l’aide d’une pipette d’aspiration fixée à une pompe à vide, remettre les cellules en suspension dans 10 millilitres de fluide frais. Transférez la suspension dans une assiette à plat de 10 centimètres et laissez-la pousser pendant 48 heures dans un incubateur ayant une température de 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Une fois que les cellules atteignent 90% de confluence, divisez-les en aspirant les anciens milieux et en les rinçant avec deux millilitres de PBS.
Ajouter deux millilitres de trypsine et les incuber pendant environ une à deux minutes à température ambiante. Lavez les cellules trypsinisées en utilisant deux millilitres du média complet. Ajoutez neuf millilitres de produits frais aux nouveaux plats.
Ajoutez ensuite un millilitre de solution de l’ancien plat au nouveau. Transférer les antennes paraboliques fractionnées dans l’incubateur pendant 48 heures pour atteindre plus de 90% de confluence. Traiter les cellules avec du diméthylsulfoxyde, huit micromolaires staurosporine ou 0,5 millimolaire de N-éthylmaléimide pendant 15 minutes avant de récolter dans un tampon de lyse.
Aspirez les médias de la boîte de culture transectée, placez les plats de culture sur de la glace et lavez les cellules avec du PBS glacé. Aspirez le PBS et ajoutez 1,0 millilitre de tampon de lyse glacée au plat. Après avoir gratté les cellules du fond de la boîte à l’aide d’un grattoir de cellules en plastique froid, transférer la suspension de cellules dans un tube microcentrifuge placé sur de la glace, suivi d’une agitation constante pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.
Après avoir centrifugé les lysats cellulaires dans une centrifugeuse froide, placez-les sur de la glace. Recueillir le surnageant dans un tube frais pré-refroidi et jeter le granulé. Pipeter 300 microlitres de sépharose de protéine G dans un tube microcentrifugeux.
Centrifuger ensuite la solution à 500 G pendant deux minutes. Après avoir jeté le surnageant, ajoutez bien 500 microlitres de PBS et de vortex. Jeter le surnageant après centrifugation et répéter l’étape.
Ensuite, mélangez un milligramme d’anticorps anti-KCC2 thréonine 906 et anti-KCC2 thréonine 1007 avec 200 microlitres de billes de sépharose de protéine G avant de porter le volume à 500 microlitres avec du PBS. Après avoir secoué sur une plate-forme vibrante ou une roue tournante pendant deux heures à quatre degrés Celsius, répétez deux lavages avec du PBS. Effectuer la quantification des protéines sur les lysats cellulaires et ajouter un milligramme du lysat cellulaire aux billes lavées et incuber dans un rotateur de bout en bout avant de tourner.
Donner trois lavages avec du PBS contenant 150 millimolaires de chlorure de sodium, suivis de trois lavages avec 200 microlitres de PBS avant de remettre en suspension la pastille finale dans 100 microlitres de tampon d’échantillon LDS. Agiter les tubes dans un agitateur à rotor à température ambiante pendant cinq minutes. Incuber dans un bloc chauffant et les centrifuger avant d’utiliser le surnageant pour la charge de gel.
Assemblez l’appareil de coulée Western Blot et versez du gel de séparation à 8% fraîchement préparé pour couler le gel, en laissant environ deux centimètres d’espace par rapport au haut du verre coulé. Ajoutez 200 microlitres d’isopropanol absolu à l’installation et laissez-la reposer à température ambiante pendant 60 minutes. Retirez l’isopropanol à l’aide d’une pipette et rincez soigneusement le gel avec environ 200 microlitres d’eau distillée.
Après avoir ajouté du gel empilable à 6% fraîchement préparé à la configuration de coulée, ajuster délicatement dans le peigne du puits et laisser reposer à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, fixez le gel moulé dans le réservoir d’électrophorèse. Après avoir versé le tampon courant dans le réservoir, chargez cinq microlitres de marqueur de poids moléculaire dans le premier puits et une quantité égale de protéines dans chaque puits du gel SDS-PAGE.
Remplissez les puits vides avec LDS et faites fonctionner le gel pendant environ 90 à 120 minutes à 120 volts. Réhydrater la membrane de nitrocellulose avec un tampon de transfert contenant 20% de méthanol. Rincez le gel et la membrane avec le tampon de transfert et étalez-les délicatement sur la pile de préparation.
Disposez le sandwich à transférer dans cet ordre: électrode négative, mousse sandwich, papier filtre gel SDS-PAGE rincé, membrane de nitrocellulose rincée, papier filtre, mousse sandwich, électrode positive. Une fois cela fait, empilez le sandwich assemblé dans le réservoir de transfert et faites fonctionner à 90 volts pendant 90 minutes ou 30 volts pendant 360 minutes. Bloquer la membrane sèche pendant une heure à température ambiante à l’aide d’un tampon de blocage.
Incuber les membranes avec des dilutions appropriées d’anticorps primaires et de bêta-actine dans un tampon de blocage pendant une heure à température ambiante ou pendant une nuit à quatre degrés Celsius. Ensuite, donnez trois lavages de TBST pendant cinq minutes chacun. Incuber la membrane lavée avec un anticorps secondaire dilué dans un tampon bloquant pendant 60 minutes et répéter trois lavages de TBST.
Une fois cela fait, placez la membrane lavée sur la carte d’imagerie. Pour développer les signaux, étaler la solution préparée en mélangeant des volumes égaux de chaque réactif de chimiluminescence améliorée sur la membrane avant de transférer la carte d’imagerie dans le système d’imagerie pour l’imagerie. Le traitement des cellules HEK293 avec de la staurosporine et du N-éthylmaléimide ou NEM a entraîné une diminution de la phosphorylation sur les sites cibles SPAK, la thréonine 233 située dans le domaine de la kinase de la boucle T et la sérine 373 du site de phosphorylation de la boucle S de SPAK exprimée de manière endogène.
La staurosporine a réduit la phosphorylation de la sérine 940 dans les cellules HEK294 exprimant de manière stable KCC2b, mais NEM a significativement augmenté sa phosphorylation. De plus, la staurosporine diminue la phosphorylation au site de la thréonine 505, alors que la NEM a provoqué une augmentation légère mais insignifiante de la phosphorylation sur le même site. Les effets différentiels des deux composés sur la phosphorylation de la protéine kinase C au site thréonine 505 et de KCC2b au site sérine 940 sont bien corrélés.
Le résultat représentatif a également montré que NEM entraînait une augmentation significative de l’expression de la quantité totale de KCC2, alors que l’expression du NKCC1 total et du SPAK n’était pas significativement modifiée lorsqu’ils étaient traités avec les deux composés. De plus, les deux composés ont provoqué une diminution de la phosphorylation de SPAK aux sites de thréonine 233 et de sérine 373, ce qui était corrélé avec la phosphorylation abrégée de la thréonine 906/1007 et de la thréonine 203/207/212 et de NKCC1 exprimée de manière endogène respectivement. De plus, la staurosporine et le NEM ont réduit et augmenté la phosphorylation de la protéine kinase C au site de la sérine 940 et exprimé de manière stable KCC2b respectivement, ce qui était corrélé avec la réduction et l’augmentation de la phosphorylation de la protéine kinase C delta au site de la thréonine 505 après le traitement par staurosporine et NEM respectivement.
Si un anticorps primaire ou secondaire inapproprié est utilisé, la bande ne sera pas visible pendant l’imagerie. En outre, le signal peut ne pas être visible si une concentration trop faible d’anticorps est utilisée. La technique est un outil pertinent dans l’analyse quantitative des protéines et a permis son utilisation à de nombreuses fins scientifiques et de ressources, y compris comme un outil de diagnostic précoce efficace.
