Les auteurs tiennent à remercier les membres du personnel du Fonds pour l&#39;Université de Deakin poisson zèbre pour fournir d&#39;excellents soins d&#39;élevage en cours. YG est soutenu par une bourse de recherche postdoctorale Alfred Deakin et une subvention de recherche du Centre de l&#39;Université Deakin. SLM est pris en charge par une bourse de développement de carrière NHMRC. ACW est soutenu par une subvention NHMRC d&#39;habilitation. Tous les auteurs sont pris en charge par le Centre de recherche sur la recherche moléculaire et médicale à l&#39;Université Deakin stratégique.

Partie 1: Traitement chimique des embryons de poisson zèbre <ol><li> Recueillir des embryons de poisson zèbre après la fécondation. Incuber à 28,5 ° C dans du milieu E3 dans 100 × 15 mm boîtes de Pétri. Remarque: Pour l&#39;hybridation in situ ou d&#39;huile rouge-O coloration, le 1-phényl-2-thio-urée (PTU) à une concentration finale de 0,2 mM est ajouté à inhiber la formation de pigment, 1 mais n&#39;est pas nécessaire pour l&#39;analyse hippocampe. </li><li> Pour les études pharmacologiques, ajouter le produit chimique nécessaire à une concentration finale appropriée pour le développement d&#39;embryons de poisson zèbre à environ 26 h après la fécondation (HPF) avec un véhicule approprié seule commande. Remarque: sensibles à la lumière inhibiteurs pharmacologiques, les embryons peuvent être autorisés à se développer dans l&#39;avant sombre à l&#39;analyse. </li></ol> Partie 2: Profil métabolique direct Utilisation de l&#39;hippocampe XF 24 Analyseur <ol><li> Avant chaque essai, la cartouche d&#39;hippocampe XF analyseur 24 qui abrite le 2 O et H <sjusqu&#39;à +&gt; fluorophores est étalonné par un processus automatisé effectuée par l&#39;analyseur. </li><li> Préparation de la plaque de 24 puits XF îlot 24. La séquence expérimentale suivante est utilisée: <ol><li> Comme la consommation d&#39;oxygène est sensible aux variations de température, quatre puits sont utilisés pour contrôler les fluctuations de température possibles à travers la plaque. Ces puits ne contiennent pas d&#39;embryons, mais sont remplis avec 700 pi de milieu E3 (figure 2A). </li><li> Les 20 autres puits (voir partie 2.2) sont remplies avec 700 ul de milieu E3 et un embryon de chacun (figure 2B). </li><li> Pour chaque expérience, 10 embryons sont traités avec le véhicule seul (témoin) et 10 patients traités avec des produits chimiques inhibiteur (traité). Embryons témoins et traités sont alternés (par exemple, ainsi A2: embryon de contrôle; ainsi A3: embryon traité: A4 ainsi: embryon de contrôle; ainsi embryon A5 traités, etc.) </li><li> Un îlot de capture d&#39;écran est ajouté sur le dessus de. chaque puits afin de s&#39;assurer que l&#39;échantillon reste dans la chambre de mesure tout au long de l&#39;essai (figure 2B) Remarque: traités chimiquement embryons restent avec leur solution chimique d&#39;origine pendant toute la procédure, sans qu&#39;il soit nécessaire de laver le produit chimique avant l&#39;exécution de l&#39;analyseur Seahorse programme. </li><li> Une fois terminé, la plaque est chargé dans l&#39;analyseur hippocampe et le test est commencé. </li></ol></li><li> L&#39;analyse des échantillons. Deux tests différents sont effectués régulièrement. <ol><li> Basale programme de la respiration respiration / maximum (durée environ 90 min.). Altérations de la respiration basale sous-tendent la dysfonction métabolique, tandis que la respiration maximale est une mesure de la capacité de production d&#39;énergie totale et des modifications de ce paramètre associé à un certain nombre de pays à la fois physiologiques et pathologiques. La capacité respiratoire de secours, ou la capacité du système pour augmenter encore la production d&#39;ATP, est également calculéà partir de ce test par la soustraction de base de respiration maximale. Trois répétitions de chaque mélange (2 min) / d&#39;attente (1 min) / mesure (2 min) cycle est effectué d&#39;abord établir la respiration basale. A la fin du troisième cycle, une concentration finale de 2,5 uM de FCCP (mitochondrial protonophore / découpleur) est ajouté à chaque puits permettant la mesure de la respiration maximale. Le cycle de mesure est répété de 5 à 8 fois (figure 3). </li><li> Programme ATP fuite chiffre d&#39;affaires / Proton (durée environ 60 min.). La respiration à cause de renouvellement de l&#39;ATP représente la fonction majeure de mitochondries dans la forme de la production d&#39;ATP, tandis que la respiration à cause de fuite de protons, ou la respiration découplée, est inextricablement liée à d&#39;autres paramètres de la fonction mitochondriale dont la respiration basale et formation d&#39;espèces réactives d&#39;oxygène. Respiration en raison du roulement ATP est représenté par la différence de respiration après l&#39;addition de 25 pM oligomycine (un inhibiteur de l&#39;ATP synthase) par rapport à la respiration basale. Respiration désaccouplée, ou en raison de la respiration fuite de protons, est déterminée en calculant la différence entre oligomycine médiée par la respiration et la respiration après l&#39;addition de 25 pM roténone (un inhibiteur du complexe I). Cycles de mesure sont répétées 8 fois après l&#39;addition de chaque inhibiteur mitochondrial. </li></ol></li></ol> A la fin des essais, les valeurs moyennes de la commande 10 et 10 embryons traités chimiquement sont calculés. Partie 3: huile rouge O coloration <ol><li> Embryons à 50 hpf sont dechorionated l&#39;aide de pinces fines et fixées dans 4% PFA nuit à 4 ° C. </li><li> Huile rouge O-coloration est effectuée, comme décrit précédemment 2 (voir Figure 4). </li></ol>

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	<li>N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish. , (2002).</li><li>Schlombs, K., Wagner, T., Scheel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-1+protease+is+required+for+cartilage+development+in+zebrafish.">Site-1 protease is required for cartilage development in zebrafish.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 14024-14029 (2003).</li><li>Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+of+the+zebrafish+for+disease+analysis.">The power of the zebrafish for disease analysis.</a> Hum. Mol. Genet. 18, R107-R112 (2009).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li><li>Stackley, K. D., Beeson, C. C., Rahn, J. J., Chan, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profiling+of+zebrafish+embryonic+development.">Bioenergetic profiling of zebrafish embryonic development.</a> Plos One. 6, e25652 (2011).</li><li>McGee, S. L., Sadli, N., Morrison, S., Swinton, C., Suphioglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DHA+protects+against+zinc+mediated+alterations+in+neuronal+cellular+bioenergetics.">DHA protects against zinc mediated alterations in neuronal cellular bioenergetics.</a> Cell Physiol. Biochem. 28, 157-162 (2011).</li><li>Sivitz, W. I., Yorek, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+diabetes:+from+molecular+mechanisms+to+functional+significance+and+therapeutic+opportunities.">Mitochondrial dysfunction in diabetes: from molecular mechanisms to functional significance and therapeutic opportunities.</a> Antioxid. Redox Signal. 12, 537-577 (2010).</li><li>Bournat, J. C., Brown, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+obesity.">Mitochondrial dysfunction in obesity.</a> Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 17, 446-452 (2010).</li><li>Ghafourifar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+multiple+sclerosis.">Mitochondria in multiple sclerosis.</a> Front Biosci. 13, 3116-3126 (2008).</li><li>Winklhofer, K. F., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease.">Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).</li><li>Maruszak, A., Zekanowski, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+Alzheimer's+disease.">Mitochondrial dysfunction and Alzheimer's disease.</a> Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 35, 320-330 (2011).</li><li>de Moura, M. B., dos Santos, L. S., S, L., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+neurodegenerative+diseases+and+cancer.">Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and cancer.</a> Environ. Mol. Mutagen. 51, 391-405 (2010).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Le poisson zèbre est un modèle génétique bien établie à la fois vers l&#39;avant (ENU mutagenèse) et arrière (Tilling, doigt de zinc nucléase ciblée knock-out, knock-down morpholino) 3,4 approches génétiques, tandis que la fonction des gènes dans les embryons de poisson zèbre peut également être facilement bloqué ou activé l&#39;aide sélective de composés pharmacologiques spécifiques pour les produits codés. En raison de leur développement externe et de petite taille, embryons de poisson zèbre sont particulièrement adaptés à l&#39;analyse métabolique. Cependant, la mesure robuste du profil métabolique et la fonction mitochondriale in vivo chez des embryons de poisson zèbre n&#39;a pas été atteint, avec une seule description préliminaire rapportée 5. Analyse Seahorse a été conçu à l&#39;origine pour les études métaboliques cellulaires et a été démontré pour donner des résultats précis et fiables 6. L&#39;application de cette nouvelle méthode d&#39;embryons de poisson zèbre est importante, et susceptible d&#39;augmenter le plus large utilisation de ce modèle pour les études métaboliques. Dans cette étude, nous démontrons la mesure de toute une gamme de paramètres de la respiration dans les embryons de poisson zèbre à l&#39;aide de l&#39;analyseur Seahorse, y compris la respiration basale, la respiration maximale, la capacité respiratoire de secours, renouvellement de l&#39;ATP et la fuite de protons. Nous fournissons également un exemple de la façon dont ces mesures peuvent être mises en corrélation avec d&#39;autres paramètres physiologiques, dans ce cas, l&#39;accumulation de lipides et de l&#39;utilisation d&#39;inhibiteurs pharmacologiques de ce système de dosage. Combinée à l&#39;utilisation d&#39;organismes génétiquement modifiés par les embryons, cela donne une puissante plate-forme expérimentale pour la compréhension des facteurs qui influent sur le métabolisme. Il existe une variété d&#39;applications pour cette nouvelle méthodologie, un dysfonctionnement mitochondrial est impliqué dans de nombreuses maladies humaines, telles que le diabète sucré 7, l&#39;obésité 8, la sclérose en plaques 9, la maladie de Parkinson 10, la maladie d&#39;Alzheimer 11 et certains types de cancers 12. Surtout, our travail est effectuée in vivo, où les influences de l&#39;environnement - tels que les cytokines, lié au développement de croissance etc - sont actifs, en fournissant ainsi une vue physiologiquement pertinente de la respiration et le profil métabolique in vivo. Comme les écrans chimiques sont aussi couramment effectuée dans le type sauvage et mutantes embryons de poisson zèbre fond (figure 1), les produits pharmaceutiques novateurs que la respiration influence, la fonction mitochondriale ou le métabolisme pourrait être facilement identifiés à l&#39;aide de l&#39;analyseur hippocampe. Les résultats obtenus en utilisant l&#39;analyseur hippocampe pourrait être utilisée en conjonction avec d&#39;autres dosages de fournir des informations supplémentaires. Cela peut inclure l&#39;analyse physiologique, tels que l&#39;huile rouge de coloration, ou l&#39;analyse moléculaire, telles que l&#39;hybridation in situ pour les marqueurs adipocytaires spécifiques tels que cebpα, PPARa, PPARy, etc SAF Il reste quelques limites à cette méthode. Bien que nous et d&#39;autres avons pu utiliser oligomycine à la mesureure la production d&#39;ATP et de fuite de protons sur les embryons jeunes 5 (voir figure 3), dans des embryons de plus de 60 hpf oligomycine traitement est inefficace. Nous croyons que dans les anciens embryons oligomycine ne peut pas diffuser aussi facilement que chez les jeunes embryons rendant les résultats impossibles à interpréter. Comme les résultats oligomycine sont obligatoires pour la détermination de la respiration à cause de renouvellement de l&#39;ATP et la respiration découplée, nous étudions actuellement des concentrations plus élevées de oligomycine pour les anciens embryons. Cependant, antimycine A traitements restent efficaces plus longtemps, avec d&#39;autres mesures, telles que la respiration basale, la respiration maximale et la capacité respiratoire de secours, peut être effectuée dans embryons de poisson zèbre âgés, jusqu&#39;à 68 hpf (non représentée). Une autre limitation dans l&#39;utilisation de la configuration actuelle Seahorse Analyser est l&#39;espace physique au sein de chaque plaque de capture et d&#39;îlots, de sorte qu&#39;ils ne conviennent que pour les embryons de poisson zèbre et les jeunes larves. Par conséquent, l&#39;exécution metabolic études sur le régime alimentaire induite par l&#39;obésité chez les poissons adultes, par exemple, n&#39;est pas encore techniquement possible. Cependant, cette étude pourrait inciter le développement des plaques spécialement conçues pour les poissons juvéniles et adultes, étendant ainsi la portée des analyses possibles.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> XF 24 analyseur de flux extracellulaire </td><td> Seahorse Bioscience </td><td> 100737-101 </td><td> Format 24 puits </td></tr><tr><td> Microplaque capture Islet </td><td> Seahorse Bioscience </td><td> 101122-100 </td><td> Format 24 puits </td></tr><tr><td> XF Calibrant Solution </td><td> Seahorse Bioscience </td><td> 100840-000 </td><td></td></tr><tr><td> Milieu de dosage XF </td><td> Seahorse Bioscience </td><td> 101022-100 </td><td></td></tr><tr><td> Huile rouge O- </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O0625 </td><td></td></tr><tr><td> 1-phényl-2-thio-urée (PTU) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7629 </td><td>/ Zfbook/chapt10.html # wptohtml51 &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html # wptohtml51 </td></tr><tr><td> E3 (moyenne embryonnaire) </td><td> Self made </td><td> - </td><td> <a href="http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16" target="_blank">http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html # wptohtml16</a> </td></tr><tr><td> 100x15 mm boîtes de Pétri </td><td> Faucon </td><td> 35-1029 </td><td></td></tr><tr><td> FCCP </td><td> Sigma </td><td> C2920 </td><td></td></tr><tr><td> Oligomycine </td><td> Sigma </td><td> 75351 </td><td></td></tr><tr><td> Un antimycine </td><td> Sigma </td><td> A8674 </td><td></td></tr></tbody></table>

metabolic profile analysis of zebrafish embryos

L&#39;un des objectifs de plus en plus dans le domaine du métabolisme est de déterminer l&#39;impact de la génétique sur les différents aspects de la fonction mitochondriale. La compréhension de ces relations aidera à comprendre l&#39;étiologie sous-jacente à toute une gamme de maladies liées à un dysfonctionnement mitochondrial, comme le diabète et l&#39;obésité. Les récents progrès dans l&#39;instrumentation, a permis à la surveillance des paramètres distincts de la fonction mitochondriale dans des lignées cellulaires ou des explants de tissus. Nous présentons ici une méthode pour une analyse rapide et sensible des paramètres de la fonction mitochondriale in vivo au cours du développement embryonnaire du poisson zèbre en utilisant le Seahorse biosciences XF 24 analyseur de flux extracellulaire. Ce protocole utilise la capture Islet microplaques où un seul embryon est placé dans chaque puits, permettant la mesure de la bioénergétique, y compris: (i) la respiration de base, (ii) la respiration mitochondriale basale (iii) la respiration mitochondriale en raison de renouvellement de l&#39;ATP, (iv) des mitochondries respiration découplée ou prOton fuite et de la respiration maximale (iv). En utilisant cette approche embryonnaires paramètres de la respiration du poisson zèbre peut être comparé entre le type sauvage et d&#39;embryons génétiquement modifiés (mutants, la sur-expression du gène ou inactivation génique) ou les manipuler pharmacologiquement. Il est prévu que la diffusion de ce protocole permettra aux chercheurs de nouveaux outils pour analyser les bases génétiques des maladies métaboliques in vivo dans ce modèle animal vertébré pertinente.

<html> Nous sommes intéressés à comprendre le rôle des gènes spécifiques sur le métabolisme, en particulier le taux de respiration et le métabolisme des lipides. Par conséquent, nous avons traité sauvages embryons de poisson zèbre à partir du mois de type HPF 26 avec un inhibiteur pharmacologique spécifique de l&#39;enzyme codée par l&#39;un de ces gènes. À 50 hpf, la moitié du véhicule et un inhibiteur embryons traités ont été analysées en utilisant le Seahorse pour la fonction mitochondriale, tandis que l&#39;autre moitié a été fixé à 4% PFA nuit à 4 ° C et ensuite colorées pour le dépôt des lipides avec de l&#39;huile-rouge-O. Le traitement par l&#39;inhibiteur de l&#39;enzyme spécifique mené une ~ 2 fois plus de respiration basale (figure 4A), qui a été associée à une augmentation des dépôts de lipides en particulier dans le télencéphale et au-dessous de la vésicule otique (Figure 4B, C). pload/4300/4300fig1highres.jpg &quot;/&gt; Figure 1. Représentation schématique du traitement chimique des embryons de poisson zèbre. Type sauvage, génétiquement manipulés, ou pharmacologiquement traitées embryons de poisson zèbre sont arrière-plan. <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig2.jpg" alt="Figure 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4300/4300fig2highres.jpg"/> Figure 2. XF24 plaque îlot mis en place. (A) Quatre puits contiennent un milieu embryonnaire seulement comme contrôle de la température (marqué par un X) et les autres contiennent un embryon / puits. (B) Close-up d&#39;un puits (C6) montrant un embryon de 50 hpf type sauvage traitées avec le véhicule (DMSO) couvert par une capture d&#39;écran îlot (tête de flèche). <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig3.jpg" alt="Figure 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4300/4300fig3highres.jpg"/> Figure 3. Respiratparamètres d&#39;ions de type sauvage pour 50 embryons de poisson zèbre HPF. (A) Pour chaque mesure, la moyenne des 20 embryons individuels est présenté. Respiration basale (moyenne: 299,7; SD: 75,7; SEM: 16,9), la respiration maximale (moyenne: 387,4; SD: 93,3; SEM: 20,9), la capacité respiratoire de secours (moyenne: 87,7; SD: 72,0; SEM: 16,1). (B) pour chaque mesure, la moyenne des résultats individuels 20 est présenté. Basale respiration mitochondriale; respiration mitochondriale en raison de renouvellement de l&#39;ATP; mitochondrial respiration découplée et non mitochondrial respiration. Mt: mitochondriale; SRC: Pièce de rechange Capacité respiratoire; SD: écart-type, SEM: erreur standard de la moyenne. Les résultats sont présentés en pmoles de O 2 consommée / min / embryon. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4300/4300fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Représentantdes résultats représentatifs de l&#39;exposition chimique sur la respiration basale et le dépôt de lipides. (A, B) 50 embryons hpf colorées avec l&#39;huile rouge O en vue latérale. L&#39;embryon incubé avec l&#39;inhibiteur sélectif (B) affiche plus d&#39;huile coloration rouge-O dans le télencéphale (tête de flèche) et en dessous de la vésicule otique (flèche) par rapport à un embryon de contrôle traité par le véhicule. (C) la respiration basale montre un ~ 2 fois plus chez les embryons traités chimiquement (n = 10 embryons par groupe). Les résultats sont présentés en pmoles de O 2 / min / embryon.

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Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

Poisson-zèbre constituent un modèle vertébré puissant qui a été sous-utilisée pour les études métaboliques. Nous décrivons ici un moyen rapide pour mesurer la<em&gt; In vivo</em&gt; Profil métabolique du poisson zèbre développement qui permet de comparer les différents paramètres de la fonction mitochondriale entre génétiquement ou pharmacologiquement embryons manipulés, ce qui augmente l&#39;applicabilité de cet organisme.

Analyse du profil métabolique des embryons de poisson zèbre

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

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Research

JoVE Journal

Biology

19.8K vues.  School of Medicine, Deakin University. Poisson-zèbre constituent un modèle vertébré puissant qui a été sous-utilisée pour les études métaboliques. Nous décrivons ici un moyen rapide pour mesurer la In vivo Profil métabolique du poisson zèbre développement qui permet de comparer les différents paramètres de la fonction mitochondriale entre génétiquement ou pharmacologiquement embryons manipulés, ce qui augmente l'applicabilité de cet organisme.

Vidéo: Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjection d&#39;ARNm et oligonucléotides antisens morpholino dans embryons de poissons zèbres.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Recherche

Biologie

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjection d&#39;embryons de poissons zèbres pour analyser la fonction génique

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Génération embryons de poissons zèbres chimériques par transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Deux-Photon-Based photoactivation dans Live embryons de poissons zèbres

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

Eucaryotes Analyse du profil polyribosome

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

Glycanes imagerie dans embryons de poissons zèbres par marquage métabolique et Chimie Cliquez Bioorthogonal

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Analyse de l&#39;apoptose dans embryons de poissons zèbres par Whole montage immunofluorescence pour détecter caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Analyse du stress oxydatif dans embryons de poissons zèbres

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Imagerie semi-automatique de la fluorescence spécifique de tissu dans embryons de poissons zèbres

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

Production de haploïdes embryons de poisson zèbre par<em&gt; In Vitro</em&gt; Engrais

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...