Le complexe synaptonémique est un composant clé de la méiose. Pour étudier sa fonction, nous devons également comprendre sa structure pour laquelle la microscopie à super résolution s’est avérée incroyablement utile. Nous avons optimisé notre protocole pour attacher de manière stable la gonade immunocolorée de C. elegans à une lamelle de couverture, ce qui contribue à améliorer la résolution jusqu’à 30 nanomètres dans les tissus intacts.
La conception d’expériences de microscopie de localisation de molécules uniques, l’analyse ultérieure ainsi que l’interprétation des données peuvent être assez difficiles et doivent être mises en place avec un expert. La démonstration de la procédure sera Ivana Cavka, boursière pré-doctorale dans le laboratoire. L’acquisition des images de microscopie de localisation de molécule unique sera également présentée par Rory Power, ingénieur optique au MBL Imaging Center.
Commencez par cueillir des vers Caenorhabditis elegans appariés selon l’âge dans des plaques de gélose NGM. Transférer les vers dans une goutte de 30 microlitres d’EBTT sur une lamelle de couverture. Lavez les vers avec 30 microlitres supplémentaires d’EBTT.
Retirez 30 microlitres de la solution en laissant une goutte de 30 microlitres avec les vers sur la lamelle de couverture. Utilisez une lame de scalpel pour couper la tête des vers et / ou la queue pour extruder la gonade. Lors d’une dissection réussie, le tissu gonade sera entièrement extrudé à l’extérieur du corps du ver.
Pipeter 30 microlitres de la solution fixatrice dans la goutte des vers disséqués. Mélanger par pipetage et laisser les échantillons fixer pendant une minute. Arrêtez la fixation exactement après une minute en transférant les vers à l’aide d’une pipette de 20 microlitres sur un tube PCR rempli de TBST.
Effectuez ensuite un lavage en faisant tourner les échantillons disséqués sur une mini centrifugeuse de paillasse. Une fois le surnageant retiré, remettez les vers en suspension dans 200 microlitres de TBST frais. Après le lavage final, remettez les vers en suspension dans 200 microlitres de PBST et placez le tube PCR sur de la glace.
Faites tourner les échantillons disséqués sur une mini centrifugeuse de paillasse et retirez le surnageant. Ajouter 50 à 100 microlitres de méthanol froid, mélanger par pipetage et laisser les échantillons dans du méthanol pendant 30 à 60 secondes sur de la glace. Lavez les échantillons deux fois avec 200 microlitres de PBST.
Après avoir fait tourner les échantillons et retiré le surnageant, ajoutez la solution bloquante aux échantillons et conservez-la à température ambiante pendant 45 à 60 minutes. Diluer les anticorps primaires dirigés contre les solutions de travail dans le tampon bloquant. Faites tourner les échantillons sur une mini-centrifugeuse de paillasse, en retirant la solution bloquante, et ajoutez 30 à 50 microlitres de la solution d’anticorps primaire.
Incuber pendant la nuit à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, laver les échantillons trois fois dans PBST. Diluez les deux fragments Fab premiers étiquetés dans les solutions de travail dans le tampon de blocage.
Après le troisième lavage, faites tourner les échantillons vers le bas, retirez le surnageant et ajoutez 30 à 50 microlitres de la solution d’anticorps secondaire. Placez l’échantillon dans une chambre sombre et incuber pendant 30 minutes à deux heures à température ambiante ou pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Ensuite, lavez les échantillons trois fois avec PBST pendant cinq à 15 minutes.
Faites tourner les échantillons colorés et retirez le surnageant. Ajouter 50 microlitres de PBST et transférer les vers colorés sur une lamelle de couverture. Pipeter 5,7 à 6,3 microlitres de la solution post-fixatrice sur une lamelle de couverture en poly-l-lycine.
Enlever à la pipette les vers disséqués dans le même volume et transférer dans la goutte de fixateur sur la lamelle de couverture de poly-l-lysine. Couvrir l’échantillon avec un petit bordereau de couverture. Retirer l’excès de liquide à l’aide d’un petit morceau de papier filtre et fixer l’échantillon pendant trois à cinq minutes dans une chambre sombre.
Congeler les échantillons en les plaçant sur un bloc d’aluminium dans de la glace sèche. Après au moins 20 minutes, retirez le plus petit couvercle à l’aide d’un rasoir. Trempez la lamelle de couverture dans un tube conique de 50 millilitres contenant du PBS glacé ou du méthanol refroidi à moins 20 degrés Celsius pendant environ 10 secondes.
Placez la lamelle de couverture dans un puits d’une plaque à six puits remplie de tampon PBST. Retirer le PBST du puits, ajouter du PBST frais et laisser l’échantillon pendant cinq minutes. Après avoir lavé avec PBST une fois de plus, laissez les échantillons à quatre degrés Celsius jusqu’à l’imagerie.
Avant l’imagerie, évaluez la qualité du montage de l’échantillon au stéréomicroscope. Si vous utilisez le porte-échantillon sur mesure illustré ici, enveloppez l’anneau magnétique avec un parafilm, puis préparez un millilitre de tampon d’imagerie. Prenez un bordereau de couverture de la plaque à six puits.
Placez-le dans le support sur mesure et fixez le couvercle dans le support avec l’anneau magnétique enveloppé de parafilm. Pipeter doucement le tampon d’imagerie dans la chambre créée par l’anneau magnétique sur le dessus de l’échantillon et sceller la chambre à l’aide d’un parafilm. Pour monter l’échantillon, ajoutez une goutte d’huile d’immersion à l’objectif d’huile propre.
Sans introduire d’air dans l’huile d’immersion, placez délicatement le porte-échantillon avec l’échantillon monté sur la platine du microscope. À l’aide de la fenêtre du plug-in EMU dans MicroManager 2, déplacez l’étage piézoélectrique jusqu’à ce que le signal du laser de verrouillage de mise au point soit détecté au niveau de la photodiode quadrant. Acquérir une image du plan focal arrière à faible puissance avec un laser à excitation de 640 nanomètres pour confirmer l’absence de bulles d’air dans l’huile d’immersion.
Localisez le tissu gonade à l’aide de l’éclairage en fond clair. En utilisant un éclairage de faible intensité à 640 nanomètres, concentrez-vous sur la section tissulaire contenant de nombreux complexes synaptonémiques. Procéder à l’exposition de l’échantillon à un éclairement énergétique élevé avec un éclairage à 640 nanomètres pendant environ 30 secondes jusqu’à ce qu’une vitesse de clignotement appropriée soit atteinte.
Acquérir 200 000 images avec un temps d’exposition de 20 millisecondes à l’aide de l’outil d’acquisition multidimensionnelle de MicroManager 2. Pendant ce temps, configurez l’activation UV à l’aide de l’option d’activation du plugin EMU pour maintenir le taux de clignotement souhaité. Le plan le plus bas des noyaux méiotiques contenant des complexes synaptonémiques a été visualisé dans une gonade de Caenorhabditis elegans en utilisant une coloration HTP-3 et SYP-5.
Les axes chromosomiques de l’extrémité C de SYP-5 HA ont été bien résolus dans les trois dimensions dans des complexes synaptonémiques situés près de la lamelle de couverture. Cependant, la résolution se détériore dans les complexes synaptonémiques situés à une distance de cinq micromètres de la lamelle de couverture en raison de la diffusion de la lumière et des aberrations sphériques. Les images acquises à différentes distances piézoélectriques du bordereau de couverture ont révélé que le tissu imagé ne devait pas être à plus de deux micromètres du lameau de couverture.
Le protocole de préparation des échantillons peut également être utilisé avec la microscopie TauSTED. Avec la préparation optimisée de l’échantillon, HTP-3 dans les axes chromosomiques et les C-termini de SYP-5 dans la région centrale ont été résolus en vue frontale et en vue légèrement inclinée. Pour obtenir la meilleure résolution, les gonades doivent être étroitement réticulées à la lamelle de couverture pour s’assurer que les complexes synaptonémiques ne sont pas à plus de deux micromètres de la lamelle de couverture.
Nous utilisons ce protocole non seulement pour la microscopie de localisation d’une seule molécule, mais aussi pour la microscopie à déplétion d’émission stimulée. Il peut également être utile pour d’autres techniques de microscopie à super résolution.
