Sinaptonemal kompleks mayozun önemli bir bileşenidir. İşlevini incelemek için, süper çözünürlüklü mikroskobun inanılmaz derecede yararlı olduğu ortaya çıkan yapısını da anlamalıyız. Protokolümüzü, immün boyalı C.elegans gonadını, bozulmamış dokularda çözünürlüğü 30 nanometreye kadar iyileştirmeye yardımcı olan bir kapak kaymasına istikrarlı bir şekilde bağlamak için optimize ettik.
Tek moleküllü lokalizasyon mikroskopi deneylerinin tasarımı, sonraki analizler ve ayrıca verilerin yorumlanması oldukça zor olabilir ve en iyisi bir uzmanla birlikte kurulmalıdır. Prosedürü gösteren, laboratuvarda doktora öncesi bir araştırmacı olan Ivana Cavka olacak. Tek moleküllü lokalizasyon mikroskopi görüntülerinin elde edilmesi, MBL Görüntüleme Merkezi'nde optik mühendisi olan Rory Power tarafından da gösterilecek.
NGM agar plakalarından yaşa uygun Caenorhabditis elegans solucanlarını toplayarak başlayın. Solucanları bir kapak kapağı üzerinde 30 mikrolitrelik bir EBTT damlasına aktarın. Solucanları ilave 30 mikrolitre EBTT ile yıkayın.
Çözeltinin 30 mikrolitresini çıkarın ve kapak kayması üzerindeki solucanlarla 30 mikrolitrelik bir damla bırakın. Gonadı ekstrüzyon yapmak için solucanların kafalarını ve / veya kuyruklarını kesmek için bir neşter bıçağı kullanın. Başarılı bir diseksiyonda, gonad dokusu solucan gövdesinin dışına tamamen ekstrüde edilecektir.
Pipet, fiksatif çözeltinin 30 mikrolitresini, disseke edilmiş solucanların damlasına dönüştürür. Pipetleme ile karıştırın ve numuneleri bir dakika boyunca sabitlenmeye bırakın. 20 mikrolitrelik bir pipet kullanarak solucanları TBST ile doldurulmuş bir PCR tüpüne aktararak sabitlemeyi tam olarak bir dakika sonra durdurun.
Ardından, disseke edilmiş numuneleri mini bir tezgah üstü santrifüj üzerinde döndürerek bir yıkama işlemi gerçekleştirin. Süpernatant çıkarıldıktan sonra, solucanları 200 mikrolitre taze TBST'de yeniden askıya alın. Son yıkamadan sonra, solucanları 200 mikrolitre PBST'de yeniden askıya alın ve PCR tüpünü buzun üzerine yerleştirin.
Disseke edilmiş numuneleri mini bir tezgah üstü santrifüj üzerinde döndürün ve süpernatanı çıkarın. 50 ila 100 mikrolitre soğuk metanol ekleyin, pipetle karıştırın ve numuneleri buz üzerinde 30 ila 60 saniye metanol içinde bırakın. Numuneleri 200 mikrolitre PBST ile iki kez yıkayın.
Numuneleri eğirdikten ve süpernatanı çıkardıktan sonra, blokaj çözeltisini numunelere ekleyin ve 45 ila 60 dakika oda sıcaklığında tutun. Birincil antikorları, bloke edici tampondaki çalışma çözeltilerine karşı seyreltin. Numuneleri mini bir tezgah üstü santrifüj üzerinde döndürün, bloke edici çözeltiyi çıkarın ve birincil antikor çözeltisinden 30 ila 50 mikrolitre ekleyin.
Gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Kuluçka sonunda, numuneleri PBST'de üç kez yıkayın. Etiketli Fab prime iki parçayı blokaj tamponundaki çalışma çözeltilerine seyreltin.
Üçüncü yıkamadan sonra, numuneleri aşağı doğru döndürün, süpernatanı çıkarın ve ikincil antikor çözeltisinden 30 ila 50 mikrolitre ekleyin. Numuneyi karanlık bir odaya yerleştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika ila iki saat veya gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra numuneleri beş ila 15 dakika boyunca PBST ile üç kez yıkayın.
Lekeli örnekleri döndürün ve süpernatanı çıkarın. 50 mikrolitre PBST ekleyin ve lekeli solucanları bir kapak kapağına aktarın. Pipet, 5.7 ila 6.3 mikrolitre post-fiksatif çözeltiyi bir poli-l-lizin kapak kapağı üzerine yerleştirin.
Piseke edilmiş solucanları aynı hacimde çıkarın ve poli-l-lizin kapak kayması üzerindeki fiksatif damlasına aktarın. Numuneyi küçük bir kapak kapağı ile örtün. Küçük bir filtre kağıdı parçası kullanarak fazla sıvıyı çıkarın ve numuneyi karanlık bir odada üç ila beş dakika sabitleyin.
Numuneleri kuru buzda alüminyum bir blok üzerine yerleştirerek dondurun. En az 20 dakika sonra, bir tıraş bıçağı kullanarak daha küçük kapak kapağını çıkarın. Kapak kapağını, yaklaşık 10 saniye boyunca eksi 20 santigrat derecede soğutulmuş buz gibi PBS veya metanol içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe batırın.
Kapak kapağını PBST tamponuyla doldurulmuş altı delikli bir plakanın kuyucuğuna yerleştirin. PBST'yi kuyudan çıkarın, taze PBST ekleyin ve numuneyi beş dakika bekletin. PBST ile bir kez daha yıkadıktan sonra, örnekleri görüntülemeye kadar dört santigrat derecede bırakın.
Görüntülemeden önce, numune montajının kalitesini stereo mikroskop altında değerlendirin. Burada gösterilen ısmarlama numune tutucuyu kullanıyorsanız, manyetik halkayı parafilmle sarın, ardından bir mililitre görüntüleme tamponu hazırlayın. Altı kuyucuklu plakadan bir kapak kayması alın.
Özel yapım tutucuya yerleştirin ve kapaklı kapağı tutucuya parafilm sarılı manyetik halka ile sabitleyin. Numunenin üstündeki manyetik halka tarafından oluşturulan odadaki görüntüleme tamponunu nazikçe pipetleyin ve odayı parafilm kullanarak kapatın. Numuneyi monte etmek için, temiz yağ hedefine bir damla daldırma yağı ekleyin.
Daldırma yağına herhangi bir hava sokmadan, numune tutucuyu monte edilmiş numuneyle birlikte mikroskop aşamasına yavaşça yerleştirin. MicroManager 2 içindeki EMU eklenti penceresini kullanarak, kadran fotodiyotunda odak kilidi lazerinden gelen sinyal algılanana kadar piezo aşamasını hareket ettirin. Daldırma yağında hava kabarcıklarının bulunmadığını doğrulamak için 640 nanometre uyarılmada bir lazerle daha düşük güçte bir arka odak düzlemi görüntüsü elde edin.
Parlak alan aydınlatmasını kullanarak gonad dokusunu lokalize edin. 640 nanometrede düşük yoğunluklu bir aydınlatma kullanarak, birçok sinaptonemal kompleks içeren doku bölümüne odaklanın. Uygun bir yanıp sönme hızı elde edilene kadar numuneyi 640 nanometrede aydınlatma ile yaklaşık 30 saniye boyunca yüksek ışımada maruz bırakmaya devam edin.
MicroManager 2'deki çok boyutlu alma aracını kullanarak 20 milisaniyelik pozlama süresine sahip 200.000 kare elde edin. Bu arada, istenen yanıp sönme hızını korumak için EMU eklentisinin etkinleştirme seçeneğini kullanarak UV aktivasyonunu ayarlayın. Sinaptonemal kompleksler içeren mayotik çekirdeklerin en alt düzlemi, HTP-3 ve SYP-5 boyaması kullanılarak bir Caenorhabditis elegans gonad içinde görselleştirildi.
SYP-5 HA'nın C-terminüsündeki kromozom eksenleri, kapak kaymasına yakın bulunan sinaptonemal komplekslerde her üç boyutta da iyi çözülmüştür. Bununla birlikte, ışık saçılması ve küresel sapmalar nedeniyle örtü kaymasından beş mikrometre uzaklıkta bulunan sinaptonemal komplekslerde çözünürlük bozulur. Örtü kaymasından farklı piezo mesafelerinde elde edilen görüntüler, görüntülenen dokunun örtü kaymadan iki mikrometreden daha fazla olmaması gerektiğini ortaya koymuştur.
Numune hazırlama protokolü TauSTED mikroskopisi ile de kullanılabilir. Optimize edilmiş numune hazırlama ile, kromozom eksenlerindeki HTP-3 ve merkezi bölgedeki SYP-5'in C-termini, önden görünümde ve hafif eğimli görünümde çözüldü. En iyi çözünürlüğü elde etmek için, gonadlar, sinaptonemal komplekslerin kapak kaymasından iki mikrometreden fazla olmamasını sağlamak için kapak kaymasına sıkıca çapraz bağlanmalıdır.
Bu protokolü sadece tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu için değil, aynı zamanda uyarılmış emisyon tükenme mikroskobu için de kullanıyoruz. Diğer süper çözünürlüklü mikroskopi teknikleri için de yararlı olabilir.
