シナプトン複合体は減数分裂の重要な要素です。その機能を研究するには、超解像顕微鏡が非常に有用であることが判明したその構造も理解する必要があります。免疫染色されたC.elegans生殖腺をカバーガラスに安定して付着させるようにプロトコルを最適化し、無傷の組織で30ナノメートルまでの分解能を向上させるのに役立ちます。
単一分子局在顕微鏡実験の設計、その後の分析、およびデータの解釈は非常に困難な場合があり、専門家と一緒に設定するのが最善です。手順を実演するのは、研究室の博士課程前のフェローであるイヴァナ・カブカです。単一分子局在顕微鏡画像の取得は、MBLイメージングセンターの光学エンジニアであるRory Powerによっても示されます。
NGM寒天プレートから年齢が一致したカエノラブディティスエレガンスワームを選ぶことから始めます。ワームをカバーガラス上のEBTTの30マイクロリットルの滴に移します。さらに30マイクロリットルのEBTTでワームを洗います。
カバーガラス上のワームで30マイクロリットルの滴を残して、30マイクロリットルの溶液を取り除きます。メスの刃を使用して、ワームの頭や尾を切り落とし、生殖腺を押し出します。解剖が成功すると、生殖腺組織は虫の体の外側に完全に押し出されます。
解剖したワームの滴に30マイクロリットルの固定液をピペットで入れます。ピペッティングで混合し、サンプルを1分間固定します。TBSTで満たされたPCRチューブに20マイクロリットルのピペットを使用してワームを移すことによって、1分後に正確に固定を停止します。
次に、解剖したサンプルをミニベンチトップ遠心分離機で回転させて洗浄を行います。上清を除去したら、200マイクロリットルの新鮮なTBSTにワームを再懸濁します。最後の洗浄後、ワームを200マイクロリットルのPBSTに再懸濁し、PCRチューブを氷上に置きます。
解剖したサンプルをミニベンチトップ遠心分離機で回転させ、上清を除去します。50〜100マイクロリットルの冷メタノールを加え、ピペッティングで混合し、サンプルを氷上で30〜60秒間メタノールに放置します。サンプルを200マイクロリットルのPBSTで2回洗浄します。
サンプルを回転させて上清を除去した後、ブロッキング溶液をサンプルに加え、室温で45〜60分間保持します。ブロッキングバッファー中の作業溶液に対する一次抗体を希釈します。ミニベンチトップ遠心分離機でサンプルを回転させ、ブロッキング溶液を除去し、30〜50マイクロリットルの一次抗体溶液を追加します。
摂氏4度で一晩インキュベートします。インキュベーションの最後に、サンプルをPBSTで3回洗浄します。標識されたFabプライム2フラグメントをブロッキングバッファー内の作業溶液に希釈します。
3回目の洗浄後、サンプルをスピンダウンし、上清を除去し、30〜50マイクロリットルの二次抗体溶液を追加します。サンプルを暗所に入れ、室温で30分から2時間、または摂氏4度で一晩インキュベートします。次に、サンプルをPBSTで5〜15分間3回洗浄します。
染色したサンプルをスピンダウンし、上清を除去します。50マイクロリットルのPBSTを加え、染色したワームをカバーガラスに移します。5.7〜6.3マイクロリットルの固定後溶液をポリ-l-リシンカバーガラスにピペットで貼り付けます。
解剖したワームを同じ容量でピペットで取り除き、ポリ-l-リジンカバーガラス上の固定液滴に移します。サンプルを小さなカバーガラスで覆います。小さなろ紙を使用して余分な液体を取り除き、暗いチャンバーで3〜5分間サンプルを固定します。
サンプルをドライアイスのアルミブロックに置いて凍結します。少なくとも20分後、かみそりを使用して小さいカバーガラスを取り外します。カバーガラスを、氷冷したPBSまたはメタノールを摂氏マイナス20度で約10秒間冷やした50ミリリットルの円錐形のチューブに浸します。
カバーガラスをPBSTバッファーで満たされた6ウェルプレートのウェルに入れます。ウェルからPBSTを取り出し、新鮮なPBSTを加えて、サンプルを5分間放置します。もう一度PBSTで洗浄した後、イメージングするまでサンプルを摂氏4度のままにします。
イメージングの前に、実体顕微鏡でサンプルマウントの品質を評価します。ここに示すオーダーメイドのサンプルホルダーを使用する場合は、磁気リングをパラフィルムで包み、1ミリリットルのイメージングバッファーを準備します。6ウェルプレートからカバーガラスを取ります。
カスタムメイドのホルダーに入れ、パラフィルムで包まれた磁気リングでカバーガラスをホルダーに固定します。サンプル上部の磁気リングによって作成されたチャンバー内のイメージングバッファーを静かにピペットで固定し、パラフィルムを使用してチャンバーを密閉します。サンプルを取り付けるには、クリーンオイル対物レンズに液浸オイルを1滴加えます。
液浸オイルに空気を入れずに、取り付けたサンプルを入れたサンプルホルダーを顕微鏡ステージにそっと置きます。MicroManager 2内のEMUプラグインウィンドウを使用して、フォーカスロックレーザーからの信号が象限フォトダイオードで検出されるまでピエゾステージを移動します。640ナノメートル励起のレーザーを使用して低出力で後焦点面画像を取得し、液浸油に気泡がないことを確認します。
明視野照明を使用して生殖腺組織を局在化します。640ナノメートルの低照度照明を使用して、多くのシナプトン複合体を含む組織切片に焦点を合わせます。適切な点滅速度が達成されるまで、640ナノメートルの照明で約30秒間、高放射照度でサンプルを露光します。
MicroManager 2の多次元取得ツールを使用して、20ミリ秒の露光時間で200、000フレームを集録します。一方、EMUプラグインのアクティベーションオプションを使用してUVアクティベーションを設定し、目的の点滅速度を維持します。シナプトン複合体を含む減数分裂核の最下面を、HTP-3およびSYP-5染色を用いてカエノラブディティス・エレガンス生殖腺内で可視化した。
SYP-5 HAのC末端の染色体軸は、カバーガラスの近くに位置するシナプトン複合体において、3次元すべてで良好に分解された。しかし、カバーガラスから5マイクロメートルの距離に位置するシナプトン複合体では、光散乱や球面収差により分解能が低下します。カバーガラスから異なるピエゾ距離で取得された画像は、画像化された組織がカバーガラスから2マイクロメートル以上離れてはならないことを明らかにした。
サンプル調製プロトコルは、TauSTED顕微鏡でも使用できます。最適化されたサンプル調製により、染色体軸のHTP-3と中央領域のSYP-5のC末端が正面図とわずかに傾いた視野で解像されました。最良の分解能を得るには、生殖腺をカバーガラスにしっかりと架橋して、シナプトン複合体がカバーガラスから2マイクロメートル以内になるようにする必要があります。
このプロトコルは、単一分子局在顕微鏡だけでなく、誘導放出枯渇顕微鏡にも使用しています。また、他の超解像顕微鏡技術にも役立つ場合があります。
