Nous tenons à souligner le financement des National Institutes of Health (R15-03 à GM065444 LB) et du Programme de recherche intra-muros des National Institutes of Health (NIH) et l&#39;Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales (KO). Une sentence NSF (DBI-0923402) a financé l&#39;acquisition d&#39;un microscope confocal LSM700. Nous tenons également à remercier l&#39;assistance générale et des commentaires utiles sur le manuscrit du Dr Andy Or. Le crédit va à l&#39;ensemble de la communauté C. elegans de partage des ressources, des protocoles et des idées.

1. Cultures nématode <ol><li> Obtenir le appropriée C. elegans souche à partir du Centre de Caenorhabditis Genetics Stock (CCG) ou d&#39;un collègue. </li><li> Cultivez les nématodes sur gélose NGM ensemencé avec une pelouse OP50 bactérienne (3). Pour l&#39;analyse de la GFP souches de croissance à 25 ° C est recommandée. </li><li> La veille de votre expérience de microscopie, ramasser au moins 40 larves L4 sur les plaques ensemencées et placer les plaques à 25 ° C pendant la nuit. Ces vers seront de jeunes adultes pour l&#39;expérience. </li></ol> 2. Injections S&#39;il est souhaitable de voir des structures comme les lysosomes ou les mitochondries, les adultes peut être injecté par un colorant fluorescent avant la visualisation. <ol><li> Préparer séchées coussinets d&#39;injection d&#39;agarose. (Cela peut être fait un à plusieurs jours d&#39;avance) <ol><li> Préparer fondue agarose à 2% dans de l&#39;eau. Avec une pipette Pasteur mettre 2 gouttes sur une lamelle 22X54 mm. Placez un autre lamelle Croix-sage sur le dessus de la goutte. Afin d&#39;obtenir l&#39;épaisseur correcte, appuyez sur la lamelle supérieure jusqu&#39;à ce que le diamètre de la plaquette est d&#39;environ 1,5 cm. Laisser reposer pendant 5-10 minutes. </li><li> Retirer lamelle supérieure. Déshydrater le pad agarose en le plaçant dans une four à 80 ° C pendant 1 heure ou permettre de s&#39;asseoir sur paillasse pendant la nuit. </li></ol></li><li> Préparer Mitotracker ou une solution Lysotracker. <ol><li> Diluer agent fluorescent dans le tampon d&#39;œufs. Nous utilisons généralement une dilution 1:10 de Mitotracker ou Lysotracker. </li><li> L&#39;aiguille d&#39;injection est faite à partir d&#39;un verre de 1,2 OD capillaire. Retirez l&#39;aiguille d&#39;injection à l&#39;aide d&#39;un tire-aiguille. </li><li> Utiliser une pipette Pastuer tiré vers l&#39;arrière de remplir l&#39;aiguille avec le colorant dilué. </li><li> L&#39;aiguille Placez dans une lumière sans, chambre humide jusqu&#39;à utilisation. </li></ol></li><li> Pré-injection: Mise en place du microscope et de l&#39;aiguille. <ol><li> Mont aiguille d&#39;injection sur l&#39;appareil d&#39;injection. Notre appareil est un micromanipulateur Narishige entraînement direct monté sur la platine d&#39;un microscope inversé Nikon TE200 équipés capacité d&#39;imagerie DIC. </li><li> Connectez l&#39;aiguille à un tube de 1,2 mm de diamètre qui est relié au régulateur de pression. Soit de l&#39;air comprimé ou d&#39;azote peut être utilisé comme une source de pression externe. Réglez le régulateur à 20-25 psi. </li><li> Déposer 2 gouttes d&#39;huile minérale lourde (huile de paraffine) sur le tampon d&#39;injection. </li><li> Placez le tampon d&#39;injection sur le microscope et abaisser l&#39;aiguille dans l&#39;huile. Assurez-vous que les flux de fluides librement de l&#39;aiguille lorsque la pression est appliquée. Appliquer une pression d&#39;injection et d&#39;observer si du liquide s&#39;écoule de l&#39;aiguille. Si non, vous aurez besoin de casser doucement l&#39;extrémité de l&#39;aiguille. L&#39;aiguille peut être rompu par la conduite en douceur la pointe dans un petit morceau de lamelle cassée mis sur le pavé d&#39;injection. Une fois l&#39;aiguille qui coule, passez à l&#39;étape suivante. </li></ol></li><li> Injection. <ol><li> Environ 1 heure avant le visionnement des embryons, le transfert vers adultes jeunes dans la goutte d&#39;huile sur le tampon d&#39;injection. Effectuer ce transfert en utilisant le microscope à dissection. Utilisez un pick ver fil de platine avec un bout pointu pour les vers de transfert. </li><li> Disposer de 3 à 10 des vers afin qu&#39;ils mentent directement sur le pad. Pour l&#39;injection, il est plus facile si les vers sont alignés parallèlement les uns aux autres et un peu moins d&#39;une longueur de vis de l&#39;autre. Une fois que les vers sont sur le pavé d&#39;injection, il est important de travailler rapidement et terminer le processus d&#39;injection avant les vers périssent de la dessiccation. </li><li> Placez la lamelle avec des vers sur la platine du microscope du microscope injection. Concentrer dans la partie centrale (rachis) du tube distal des gonades. Ensuite, utilisez le micromanipulateur de déplacer la pointe de l&#39;aiguille dans le même plan focal. Déplacer la scène horizontalement de sorte que le ver est percé par l&#39;aiguille. Une fois la pointe de l&#39;aiguille est à l&#39;intérieur du rachis, appliquer la pression et permettent la gonade à remplir avec le mélange de colorant. Injecter deux bras gonades de tous les vers sur le pavé d&#39;injection. </li><li> Après l&#39;injection, l&#39;utilisation d&#39;une pipette Pasteur tiré pour livrer environ 0,5 ml de tampon d&#39;œufs aux vers. Cela va les empêcher de mourir de déshydratation et de leur permettre de récupérer de la procédure d&#39;injection. </li><li> Autoriser les vers de récupérer pendant 1-2 heures à température ambiante dans une lumière libre, chambre humidifiée. </li></ol></li></ol> 3. Agarose pad pour la visualisation des embryons <ol><li> Préparer fondue agarose à 2% dans le tampon d&#39;œufs. </li><li> Avec une pipette Pasteur, mettre 3 gouttes d&#39;agarose fondu sur une lame de microscope propre. </li><li> Placer la lame entre deux autres diapositives qui ont une couche de l&#39;étiquetage des bandes qui les recouvre. Celles-ci servent entretoises qui assureront que votre pad agarose est la bonne épaisseur. </li><li> Placer une lame de microscope propre secondes perpendiculairement vers le bas sur les gouttes d&#39;agarose. Appuyez jusqu&#39;à ce chariot supérieur repose sur bande à partir de diapositives guide. </li><li> Juste avant que vous soyez prêt à monter embryons d&#39;observation, de retirer la lame supérieure. </li></ol><ol><li> Si les vers n&#39;ont pas été injectés, suivez les deux étapes suivantes. Sinon les sauter. <ol><li> Choisissez les vers adultes jeunes de la plaque qui a été préparé la veille. Vous devriez être capable de voir l&#39;intérieur de l&#39;embryon chez les jeunes adultes. </li><li> Choisissez les vers 50-20 sur une plaque non ensemencée NGM. Autoriser les vers à ramper sur la plaque non ensemencée pendant quelques minutes afin que les vers vont perdre la plupart des bactéries qui est collé à eux. </li></ol></li><li> D&#39;obtenir des embryons jeunes de vers adultes <ol><li> Déposer une goutte de 50 à 20 pi de tampon d&#39;œufs au milieu d&#39;une lamelle de verre de 18 mm 2 (d&#39;une épaisseur de 1,5 lamelle est préférable). </li><li> Déplacer vers de la plaque non ensemencée ou un tampon d&#39;injection dans la goutte de tampon Egg. </li><li> Couper Worms Open avec une aiguille hypodermique de calibre 26. Couper le ver près de la vulve. Vous devriez voir embryons déborder du ver. </li></ol></li><li> Monter sur lame de microscope <ol><li> Inverser la lame de microscope qui a été préparé avec le pad agarose et l&#39;abaisser sur la lamelle avec des embryons. </li><li> Si laps de temps prolongé est nécessaire, utiliser de la vaseline pour sceller les bords de la lamelle pour éviter la dessiccation. </li></ol></li></ol> 5. Microscopie <ol><li> Trouver les embryons appropriés. <ol><li> Placer la lame sur la platine du microscope. Scan avec lentille de 10X à trouver des embryons. </li><li> Pour trouver embryons au stade précoce, la recherche des embryons qui sont en train de terminer la méiose maternelle. Embryons méiotique peuvent être distinguées à partir d&#39;embryons plus tard parce qu&#39;elles n&#39;ont pas subi un raccourcissement. (Après avoir terminé la méiose embryons, vous pouvez voir un écart important entre la membrane cellulaire et la coquille d&#39;oeuf à l&#39;extrémité antérieure.) </li><li> Lorsque vous avez identifié une mise en scène de façon appropriée l&#39;embryon, se déplacer à une lentille de grossissement plus élevé pour l&#39;enregistrement de l&#39;embryogenèse. </li></ol></li><li> Imagerie <ol><li> Dans cet exemple, nous imaginons des embryons qui expriment les mCherry:: H2B et GFP:: Ub protéines marquées. Nous utilisons le Zeiss LSM700 microscope classique à balayage laser. </li><li> Les images sont recueillies à l&#39;aide de la lentille 63X 1.4NA. Les 488 et 555 lasers sont utilisés avec la puissance laser minimale et un gain maximum. Pile AZ sont collectées tous les 10-15 secondes. Selon l&#39;ampleur de photoblanchiment, 30-60 points de temps sont recueillies. Images pile Z sont regroupées en une image de projection maximale pour la finale time-lapse vidéo. </li></ol></li></ol> 6. Les résultats représentatifs: <img src="/files/ftp_upload/2852/2852fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Fécondation à première mitose en C. elegans. <img src="/files/ftp_upload/2852/2852fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Procédure de micro-injection. Vidéo complémentaires 1 Time-lapse vidéo de la GFP:.. Bleu ubiquitine ainsi Lysotracker dans un embryon méiotique <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2852/2852fig3.avi">Cliquez ici pour visionner la vidéo.</a>

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	<li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection.">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. (18), e833-e833 (2008).</li><li>Hochbaum, D., Ferguson, A. A., Fisher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Transgenic+C.+elegans+by+Biolistic+Transformation.">Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation.</a> J Vis Exp. (42), e2090-e2090 (2010).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genetics+of+Caenrohabditis+elegans.">The Genetics of Caenrohabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Oegema, K., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+division+WormBook.">Cell division WormBook.</a> , (2006).</li><li>McNally, K. L., McNally, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+initiates+the+transition+from+anaphase+I+to+metaphase+II+during+female+meiosis+in+C.+elegans.">Fertilization initiates the transition from anaphase I to metaphase II during female meiosis in C. elegans.</a> Dev Biol. 282, 218-230 (2005).</li><li>Sato, K., Sato, M., Audhya, A., Oegema, K., Schweinsberg, P., Grant, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+caveolin-1+trafficking+in+the+germ+line+and+embryo+of+Caenorhabditis+elegans.">Dynamic regulation of caveolin-1 trafficking in the germ line and embryo of Caenorhabditis elegans.</a> Mol Biol Cell. 17, 3085-3094 (2006).</li><li>Stitzel, M. L., Pellettieri, J., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+DYRK+Kinase+MBK-2+Marks+Oocyte+Proteins+for+Degradation+in+Response+to+Meiotic+Maturation.">The C. elegans DYRK Kinase MBK-2 Marks Oocyte Proteins for Degradation in Response to Meiotic Maturation.</a> Curr Biol. 16, 56-62 (2006).</li><li>Schetter, A., Askjaer, P., Piano, F., Mattaj, I., Kemphues, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoporins+NPP-1,+NPP-3,+NPP-4,+NPP-11+and+NPP-13+are+required+for+proper+spindle+orientation+in+C.+elegans.">Nucleoporins NPP-1, NPP-3, NPP-4, NPP-11 and NPP-13 are required for proper spindle orientation in C. elegans.</a> Dev. Biol. 289, 360-371 (2006).</li><li>Samuel, A. D., Murthy, V. N., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+during+fertilization+in+C.+elegans.">Calcium dynamics during fertilization in C. elegans.</a> BMC Dev Biol. 1, (2001).</li><li>Badrinath, A. S., White, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+patterns+of+mitochondrial+redistribution+in+the+early+lineages+of+Caenorhabditis+elegans+and+Acrobeloides+sp.+PS1146.">Contrasting patterns of mitochondrial redistribution in the early lineages of Caenorhabditis elegans and Acrobeloides sp. PS1146.</a> Dev. Biol. 258, 270-275 (2003).</li><li>Johnston, W. L., Krizus, A., Dennis, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eggshell+is+required+for+meiotic+fidelity,+polar-body+extrusion+and+polarization+of+the+C.+elegans+embryo.">The eggshell is required for meiotic fidelity, polar-body extrusion and polarization of the C. elegans embryo.</a> BMC Biol. 4, 35-35 (2006).</li><li>Parry, J. M., Velarde, N. V., Lefkovith, A. J., Zegarek, M. H., Hang, J. S., Ohm, J., Klancer, R., Maruyama, R., Druzhinina, M. K., Grant, B. D., Piano, F., Singson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGG-4+and+EGG-5+Link+Events+of+the+Oocyte-to-Embryo+Transition+with+Meiotic+Progression+in+C.+elegans.">EGG-4 and EGG-5 Link Events of the Oocyte-to-Embryo Transition with Meiotic Progression in C. elegans.</a> Curr Biol. 19, 1752-1757 (2009).</li><li>Centonze, V. E., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+excitation+provides+optical+sections+from+deeper+within+scattering+specimens+than+confocal+imaging.">Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging.</a> Biophys J. 75, 2015-2024 (1998).</li><li>Zinselmeyer, B. H., Dempster, J., Wokosin, D. L., Cannon, J. J., Pless, R., Parker, I., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+microscopy+and+multidimensional+analysis+of+cell+dynamics.">Two-photon microscopy and multidimensional analysis of cell dynamics.</a> Methods Enzymol. 461, 349-378 (2009).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Après la fusion avec le spermatozoïde, le zygote subit une série d&#39;événements dynamiques. Ces événements transforment l&#39;ovocyte d&#39;une cellule relativement statique dans l&#39;embryon qui se développe rapidement. Dans de nombreux organismes, des réarrangements cytoplasmiques sont essentielles pour l&#39;établissement de la polarité embryonnaire et pour l&#39;activation de l&#39;œuf. Le C. embryons elegans fournit une excellente occasion d&#39;observer ces événements précoces de l&#39;activation de l&#39;œuf et l&#39;embryogenèse. L&#39;embryon est transparent et le début des événements de développement se produisent assez rapidement après la fécondation. C. chercheurs elegans ont généré de nombreuses souches utiles transgéniques qui expriment des protéines marquées par fluorescence impliqués dans le développement précoce. L&#39;utilisation de ces souches ainsi que l&#39;ARNi ou mutants fournit un système puissant pour disséquer les voies moléculaires qui sous-tendent le développement d&#39;un organisme multicellulaire (5, 6, 7, 8). Cet article présente la vidéo d&#39;une approche pratique à l&#39;utilisation de ces outils et techniques pour enregistrer les événements pendant l&#39;embryogenèse au début de C. elegans. La maturité C. ovocyte elegans est arrêté en prophase de la méiose I et est fécondé dans la spermathèque de l&#39;hermaphrodite adulte. Après la fécondation, l&#39;ovocyte produit à travers le reste de la méiose I et II. Ces étapes peuvent être observées à l&#39;aide marqué par fluorescence histone H2B (5). Durant le processus de la méiose maternelle, l&#39;ADN du sperme reste condensée (voir Figure 1). Après l&#39;achèvement de la méiose, l&#39;ADN maternel et paternel devient décondensée et la forme deux pronuclei. Le pronucleus maternel migre vers le pronucleus paternel et ils se réunissent près du centre de l&#39;embryon. Mitose s&#39;ensuit rapidement après la rencontre pronucléaire. Tous ces événements se produisent dans moins d&#39;une heure. Ainsi, la microscopie time-lapse de cette séquence d&#39;événements peut être facilement accompli. L&#39;exécution de cette technique nécessite certaine facilité à la culture de nématodes ainsi que des compétences de base dans la microscopie Outre l&#39;accès à un microscope confocal. L&#39;exemple présenté ici utilise une transgéniques C. elegans souche qui exprime deux protéines fluorescentes, GFP:: ubiquitine et mCherry:: H2B. Un microscope confocal à balayage laser est utilisé pour observer la localisation dynamique de ces deux protéines. En outre, nous montrons que l&#39;injection de Lysotracker marqué par fluorescence peut être utilisée pour suivre le devenir des lysosomes dans l&#39;embryon après la fécondation. L&#39;injection d&#39;un traceur marqué peut également être effectuée pour la visualisation des concentrations de calcium mitochondries ou locale (9). En théorie, le protocole d&#39;injection pourrait être utilisé pour afficher tout type de molécule marquée par fluorescence dans l&#39;embryon. Cela pourrait inclure de petites molécules étiquetées, protéines, lipides, etc Dans certains cas, il peut ne pas être nécessaire d&#39;injecter des trackers réalité étiquetés comme les vers volontiers absorption des colorants tels que Mitotracker (10). Cependant, nous avons essayé les deux trempage et l&#39;injection de Lysotracker et ont trouvé des résultats bien meilleurs avec une injection pour la visualisation dans les embryons. Considérations techniques: Les défis techniques présentées avec cette procédure incluent la technique de microinjection ainsi que la difficulté en imagerie très jeunes embryons. Concernant microinjections, l&#39;épaisseur de la plaquette d&#39;injection d&#39;agarose est critique pour des injections de succès. Si le tampon est trop épaisse, les vers et les dessécher meurent rapidement. Si le tampon est trop mince, les vers ne colle pas au pad pendant le processus d&#39;injection. Les embryons peuvent être sensibles aux conditions environnementales comme la température et les conditions de tampon. Embryons de type sauvage devrait lancer décondensation de l&#39;ADN des spermatozoïdes et de la migration au sein pronucléaire une minute ou deux de terminer la méiose II (4). Dans les 20 minutes, le premier devrait commencer à la cytokinèse. Si les embryons sont exposés à l&#39;intensité du laser sont très élevés ou trop chaud ou écrasés lors du montage, ce processus peut être perturbé. Ces embryons seront arrêter le développement. Si cela se produit, l&#39;expérience devrait être répétée avec la puissance du laser ou une diminution plus épais tapis d&#39;agarose. C. elegans embryons ne sécrètent pas de leur coquille d&#39;œuf jusqu&#39;à peu de temps après la fécondation. Pendant la courte période entre la fécondation et la sécrétion de la coquille d&#39;œuf, les embryons ne sont pas viables en dehors de la mère (11). Certains laboratoires ont évité ce problème en imagerie embryons in utero (5, 12). In utero imagerie offre certains avantages comme la possibilité de capturer les événements qui se produisent pendant ou juste après la fécondation. Cependant, cette technique nécessite l&#39;utilisation d&#39;un système de microscopie qui permet pour l&#39;imagerie des tissus profonds. Les systèmes tels que deux photons ou multi-photons sont particulièrement adaptés pour cela (13, 14). Lorsque vous utilisez un conventionnels à balayage laser ou la filature de microscope confocal à disque, les meilleures images sont obtenues à partir d&#39;embryons qui haai été coupé du ver adulte comme décrit ici. Considérations Système d&#39;imagerie: Le type de système d&#39;imagerie confocale utilisée dépend des besoins des utilisateurs. En général, les systèmes laser à balayage sont recommandés si l&#39;on souhaite acquérir des images avec la meilleure résolution possible. D&#39;autre part, les systèmes à disque rotatif sont mieux adaptés pour les procédés d&#39;imagerie hautement dynamiques comme l&#39;acquisition d&#39;image est relativement rapide et photoblanchiment / phototoxicité est réduite. Les paramètres d&#39;imagerie spécifiques varieront selon le modèle expérimental et le système d&#39;imagerie confocale employés. En imagerie multidimensionnelle, il faut considérer le nombre de canaux, plans focaux, et le temps des points recueillis. En raison des effets limitatifs de photoblanchiment et de phototoxicité, un nombre fini d&#39;images peuvent être acquises en toute expérience donnée. Ainsi, si vous choisissez d&#39;augmenter le nombre de canaux devant être acquis, vous aurez probablement besoin de réduire le nombre de plans focaux et / ou des points de temps et vice versa. Le nombre total d&#39;images pouvant être acquises sera influencée par l&#39;intensité du fluorophore étant imagé ainsi que la sensibilité du microscope confocal utilisé. Fluorophores plus intense et plus des instruments sensibles, il faudra le temps d&#39;exposition plus courte et donc produire moins de photoblanchiment et de phototoxicité. Un grand nombre ou de systèmes d&#39;imagerie sont disponibles. Nous vous donnerons des détails sur les systèmes qui ont été utilisées dans nos propres laboratoires. Pour les embryons vers l&#39;imagerie par microscopie à filer le disque confocale, nous utilisons un microscope inversé Nikon TE2000U équipé d&#39;un 60X/1.4 NA plan objectif Apo. Le microscope est relié à une unité de Yokogawa CSU10 disque rotatif, un Hamamatsu C9100-13 EM caméra CCD et un Spectral Applied Research LMM5 laser module de fusion contenant quatre lasers à solide avec une production à 405, 491, 561 et 655 nm. Grâce à ce système nous pouvons capturer un ou deux canaux, six à douze plans focaux, 25 à 50 points dans le temps (30 à 60 secondes d&#39;intervalle). Un temps d&#39;exposition typique est de 100 à 200 millisecondes. Pour les embryons d&#39;imagerie à balayage laser microscopie confocale, nous utilisons un Zeiss LSM700 équipé de 2 canaux et quatre lasers à semi-conducteurs (405, 488, 555 et 635 nm). Ce système est relié à un microscope inversé Zeiss Axio Observer avec un objectif de Plan-Apo 63X/1.4NA utilisés pour l&#39;imagerie embryon. Le système utilise le logiciel Zeiss ZEN pour l&#39;acquisition d&#39;image qui fournit également le traitement d&#39;image limitée et d&#39;analyse. Lorsque l&#39;imagerie par deux fluorochromes, nous avons généralement de recueillir 1-5 plans focaux (~ 0,5 um d&#39;intervalle) et de recueillir une pile Z toutes les 15 secondes. Les collections sont poursuivie jusqu&#39;en photoblanchiment significatif n&#39;est intervenu. Pour générer la finale time-lapse vidéo, images pile Z sont consolidées en utilisant l&#39;outil de projection maximale dans le logiciel ZEN. Les vidéos sont exportées à partir du logiciel en tant que fichiers AVI.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Composition </th></tr><tr><td> Egg Tampon </td><td></td><td></td><td> 5mM pH 7,2 Hepes, 110mm de NaCl, 4mm KCl, 5 mM acétate de Mg, CaCl 2 5mM </td></tr><tr><td> Mitotracker </td><td> Invitrogen </td><td> M-7512 </td><td></td></tr><tr><td> Lysotracker </td><td> Invitrogen </td><td> L-7525 </td><td></td></tr><tr><td> Pipet injection capillaire </td><td> Harvard Apparatus, Kent, Royaume-Uni </td><td> GC120F-10 </td><td></td></tr><tr><td> Extracteur d&#39;aiguilles </td><td> Kopf </td><td> Modèle 700C </td><td></td></tr><tr><td> Appareil microinjecteur </td><td> Tritech recherche </td><td> MINj-1 régulateur de microinjection </td><td></td></tr></tbody></table>

time-lapse microscopy of early embryogenesis in caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans a souvent été utilisé comme système modèle dans les études du début du processus de développement. La transparence des embryons, les ressources génétiques, et la relative facilité de transformation sont des qualités qui font de C. elegans un excellent modèle pour l&#39;embryogenèse précoce. À base de laser microscopie confocale et les étiquettes marquées par fluorescence permettent aux chercheurs de suivre les structures cellulaires spécifiques et des protéines dans l&#39;embryon en développement. Par exemple, on peut suivre des organites spécifiques, comme les lysosomes ou les mitochondries, utilisant des colorants marqués par fluorescence. Ces colorants peuvent être livrés à l&#39;embryon précoce au moyen de micro-injection dans la gonade adulte. En outre, la localisation des protéines spécifiques peuvent être suivis en utilisant les balises protéine fluorescente. Des exemples sont présentés ici, montrant l&#39;utilisation d&#39;un colorant fluorescent lysosomale ainsi que par fluorescence taggés protéines histones et l&#39;ubiquitine. Les histones étiquetées est utilisée pour visualiser l&#39;ADN et ainsi d&#39;identifier le stade du cycle cellulaire. GFP-taggés ubiquitine révèle la dynamique des vésicules ubiquitinées dans l&#39;embryon précoce. Observations des lysosomes étiquetés et GFP:: ubiquitine peut être utilisé pour déterminer s&#39;il ya colocalisation entre les vésicules ubiquitinées et des lysosomes. Une technique pour la micro-injection du colorant lysosomale est présenté. Techniques pour générer des souches transgenenic sont présentées ailleurs (1, 2). Pour l&#39;imagerie, les embryons sont découpées dans des nématodes adultes et hermaphrodites monté sur coussinets d&#39;agarose 2% suivie par la microscopie time-lapse sur un laser standard microscope confocal à balayage ou un microscope confocal à disque rotatif. Cette méthodologie fournit pour la visualisation haute résolution de l&#39;embryogenèse précoce.

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Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Cet article décrit une technique pour la visualisation des événements précoces de l&#39;embryogenèse chez le nématode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;.

Time-lapse de microscopie du début de l&#39;embryogenèse dans les Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

17.8K vues.  University of Alabama in Huntsville. Cet article décrit une technique pour la visualisation des événements précoces de l'embryogenèse chez le nématode Caenorhabditis elegans.

Vidéo: Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Surveillance actine démontage Time-lapse microscopie

Recherche

Biologie

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Imagerie time-lapse de la mitose après transfection de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

L&#39;isolement et la In vitro Activation des Caenorhabditis elegans Sperme

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

Analyse quantitative des migrations au hasard des cellules en utilisant la microscopie vidéo time-lapse

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

De base<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Méthodes: Synchronisation et d&#39;observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

L&#39;utilisation de la microscopie à Time Lapse Visualisez anoxie induite Suspended Animation en<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryons

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Extraction de prostaglandine et de l&#39;analyse en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

Mesure des taux de consommation d’oxygène intactes de Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

Étiquetage spécifique des nucléoïdes mitochondriaux pour la microscopie d’illumination structurée time-lapse

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits obesity and many associated diseases including cardiovascular disorders, type II diabetes, and cancer. To advance the current understanding of lipid metabolic regulation, quantitative methods to precisely measure in vivo lipid storage levels in time and space have become increasingly important and useful. Traditional approaches to analyze lipid storage are semi-quantitative for microscopic assessment or lacking spatio-temporal information for biochemical measurement. Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology that enables rapid and quantitative detection of lipids in live cells with a subcellular resolution. As the contrast is exploited from intrinsic molecular vibrations, SRS microscopy also permits four-dimensional tracking of lipids in live animals. In the last decade, SRS microscopy has been widely used for small molecule imaging in biomedical research and overcome the major limitations of conventional fluorescent staining and lipid extraction methods. In the laboratory, we have combined SRS microscopy with the genetic and biochemical tools available to the powerful model organism, Caenorhabditis elegans, to investigate the distribution and heterogeneity of lipid droplets across different cells and tissues and ultimately to discover novel conserved signaling pathways that modulate lipid metabolism. Here, we present the working principles and the detailed setup of the SRS microscope and provide methods for its use in quantifying lipid storage at distinct developmental timepoints of wild-type and insulin signaling deficient mutant C. elegans.

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows selective, label-free imaging of specific chemical moieties and it has been effectively employed to image lipid molecules in vivo. Here, we provide a brief introduction to the principle of SRS microscopy and describe methods for its use in imaging lipid storage in Caenorhabditis elegans.

Imagerie sans étiquette de la dynamique de stockage des lipides chez Caenorhabditis elegans à l’aide de la microscopie de diffusion Raman stimulée

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...