קומפלקס סינפטונמלי הוא מרכיב מפתח למיוזה. כדי ללמוד את תפקידו, עלינו גם להבין את המבנה שלה אשר מיקרוסקופיה ברזולוציית סופר התברר להיות שימושי להפליא. ביצענו אופטימיזציה של הפרוטוקול שלנו כדי להצמיד ביציבות גונד C.elegans חסר חיסון לכיסוי המסייע לשפר את הרזולוציה עד 30 ננומטר ברקמות שלמות.
התכנון של ניסויי מיקרוסקופיה של לוקליזציה של מולקולה בודדת, הניתוח שלאחר מכן, וגם הפרשנות של הנתונים יכולים להיות מאתגרים למדי ויש להגדיר אותם בצורה הטובה ביותר יחד עם מומחה. מי שתדגים את ההליך תהיה איוונה קבקה, עמיתת קדם-דוקטורט במעבדה. רכישת תמונות המיקרוסקופיה של לוקליזציה של מולקולה בודדת תוצג גם על ידי רורי פאוור, מהנדס אופטיקה במרכז ההדמיה MBL.
התחילו בקטיף תולעי Caenorhabditis elegans תואמות גיל מצלחות אגר NGM. מעבירים את התולעים לטיפה של 30 מיקרוליטר של EBTT על גבי כיסוי. לשטוף את התולעים עם 30 microliters נוספים של EBTT.
הסר 30 microliters של הפתרון משאיר טיפה 30 microliter עם התולעים על הכיסוי. השתמש בלהב אזמל כדי לחתוך את ראשי התולעים ו / או את הזנבות כדי לבלוט את הגונדה. בדיסקציה מוצלחת, רקמת הגונד תובלט במלואה מחוץ לגוף התולעת.
פיפטה 30 מיקרוליטר של הפתרון המקובע לתוך טיפת התולעים המנותקות. מערבבים על ידי פיפטינג ומשאירים את הדוגמאות לתיקון למשך דקה אחת. עצור את הקיבוע בדיוק לאחר דקה אחת על ידי העברת התולעים באמצעות פיפטה של 20 מיקרוליטר על צינור PCR מלא ב- TBST.
לאחר מכן בצע שטיפה על ידי סיבוב הדגימות המנותקות על צנטריפוגה מיני ספסל. לאחר הסרת הסופרנטנט, יש להשעות את התולעים ב-200 מיקרוליטרים של TBST טרי. לאחר הכביסה הסופית, להשעות את התולעים ב 200 microliters של PBST ולהניח את צינור PCR על קרח.
סובבו את הדגימות המנותחות על צנטריפוגה מיני ספסל והסירו את הסופר-נטנט. הוסיפו 50 עד 100 מיקרוליטרים של מתנול קר, ערבבו בפיפטציה והשאירו את הדגימות במתנול למשך 30 עד 60 שניות על הקרח. לשטוף את הדגימות פעמיים עם 200 microliters של PBST.
לאחר סיבוב הדגימות והסרת הסופרנטנט, הוסיפו את תמיסת החסימה לדגימות ושמרו אותה בטמפרטורת החדר למשך 45 עד 60 דקות. לדלל את הנוגדנים העיקריים לפתרונות העבודה במאגר החסימה. סובבו את הדגימות על צנטריפוגה קטנה, הסירו את תמיסת החסימה, והוסיפו 30 עד 50 מיקרוליטרים של תמיסת הנוגדנים העיקרית.
לדגור לילה בארבע מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, לשטוף את הדגימות שלוש פעמים PBST. דלל את שני השברים המסומנים Fab prime לפתרונות העבודה במאגר החסימה.
לאחר השטיפה השלישית, סובבו את הדגימות, הסירו את הסופרנטנט והוסיפו 30 עד 50 מיקרוליטרים של תמיסת הנוגדנים המשנית. מניחים את הדגימה בחדר חשוך ודוגרים במשך 30 דקות עד שעתיים בטמפרטורת החדר או לילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBST במשך חמש עד 15 דקות.
סובבו את הדגימות המוכתמות והסירו את הסופר-נטנט. מוסיפים 50 מיקרוליטרים של PBST ומעבירים את התולעים המוכתמות לכיסוי. פיפטה 5.7 עד 6.3 מיקרוליטר של התמיסה הפוסט-קיבוצית על כיסוי פולי-ל-ליצין.
מפרקים את התולעים המנותקות באותו נפח ומעבירים לטיפת הקיבוע על כיסוי הפולי-ל-ליזין. מכסים את הדגימה בכיסוי קטן. הסר את עודפי הנוזלים באמצעות פיסת נייר סינון קטנה ותקן את הדגימה במשך שלוש עד חמש דקות בחדר חשוך.
הקפיאו את הדגימות על ידי הנחתן על גוש אלומיניום בקרח יבש. לאחר 20 דקות לפחות, יש להסיר את הכיסוי הקטן יותר באמצעות סכין גילוח. טבלו את הכיסוי בצינור חרוטי בקוטר 50 מיליליטר המכיל PBS קר כקרח או מתנול מקורר במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך כ-10 שניות.
מניחים את הכיסוי לתוך באר של צלחת בת שש בארות מלאה במאגר PBST. מוציאים את ה-PBST מהבאר, מוסיפים PBST טרי ומשאירים את הדגימה למשך חמש דקות. לאחר שטיפה עם PBST שוב, להשאיר את הדגימות על ארבע מעלות צלזיוס עד הדמיה.
לפני ההדמיה, הערך את איכות הדגימה המורכבת תחת מיקרוסקופ סטריאו. אם אתה משתמש במחזיק הדגימה המותאם אישית המוצג כאן, עטוף את הטבעת המגנטית בפרפילם, ולאחר מכן הכן מיליליטר אחד של מאגר הדמיה. קח כיסוי מצלחת שש הבארות.
הניחו אותו במחזיק המותאם אישית וקבעו את הכיסוי במחזיק באמצעות הטבעת המגנטית העטופה בפארפילם. פיפטה עדינה של חיץ ההדמיה בתא שנוצר על ידי הטבעת המגנטית על גבי הדגימה ואטמו את התא באמצעות פרפילם. כדי להרכיב את הדגימה, הוסיפו טיפה אחת של שמן טבילה למטרת השמן הנקי.
מבלי להכניס אוויר לשמן הטבילה, הניחו בעדינות את מחזיק הדגימה עם הדגימה המותקנת על במת המיקרוסקופ. באמצעות חלון תוסף EMU בתוך MicroManager 2, הזז את שלב piezo עד שהאות מלייזר נעילת המיקוד מזוהה בפוטודיודה הרביע. קבל תמונת מישור מוקד אחורי בעוצמה נמוכה יותר עם לייזר בעירור של 640 ננומטר כדי לאשר את היעדר בועות האוויר בשמן הטבילה.
לוקליזציה של רקמת הגונד באמצעות תאורת השדה הבהיר. באמצעות תאורה בעוצמה נמוכה של 640 ננומטר, התמקדו בקטע הרקמה המכיל קומפלקסים סינפטונמליים רבים. המשך לחשוף את הדגימה בהקרנה גבוהה עם תאורה של 640 ננומטר למשך כ-30 שניות עד להשגת קצב מצמוץ מתאים.
רכוש 200, 000 מסגרות עם זמן חשיפה של 20 אלפיות השנייה באמצעות כלי הרכישה הרב-ממדי ב- MicroManager 2. בינתיים, הגדר את הפעלת ה- UV באמצעות אפשרות ההפעלה של תוסף EMU כדי לשמור על קצב המצמוץ הרצוי. המישור התחתון ביותר של גרעינים מיוטיים המכילים קומפלקסים סינפטונמליים הודגם בתוך גונד Caenorhabditis elegans באמצעות מכתים HTP-3 ו- SYP-5.
צירי הכרומוזומים בסיומת C של SYP-5 HA נפתרו היטב בכל שלושת הממדים בקומפלקסים סינפטונמליים הממוקמים קרוב לכיסוי. עם זאת, הרזולוציה מתדרדרת במתחמים סינפטונמליים הממוקמים במרחק של חמישה מיקרומטרים מהכיסוי עקב פיזור אור וסטיות כדוריות. תמונות שנרכשו במרחקים שונים של piezo מהכיסוי גילו כי הרקמה המצולמת לא צריכה להיות רחוקה יותר משני מיקרומטרים מהכיסוי.
פרוטוקול הכנת הדגימה יכול לשמש גם עם מיקרוסקופיה TauSTED. עם הכנת הדגימה הממוטבת, HTP-3 בצירי הכרומוזומים וה- C-termini של SYP-5 באזור המרכז נפתרו במבט חזיתי ובתצוגה מוטה מעט. כדי להשיג את הרזולוציה הטובה ביותר, הגונדות חייבות להיות מקושרות בחוזקה לכיסוי כדי להבטיח שמתחמי הסינפטונמליים יהיו במרחק של לא יותר משני מיקרומטרים מהכיסוי.
אנו משתמשים בפרוטוקול זה לא רק למיקרוסקופיה של לוקליזציה של מולקולות בודדות, אלא גם למיקרוסקופיה של דלדול פליטה מגורה. זה עשוי להיות שימושי גם עבור טכניקות מיקרוסקופיה אחרות ברזולוציה גבוהה.
