La stratégie visant à exclure les neurones à l’aide du tri FACS négatif génère des taux de séquençage d’ARN de haute qualité de population cellulaire de faible abondance, comme les cellules souches neurales, les astrocytes et les oligodendrocytes, afin d’étudier leur rôle dans la modulation de la neurogenèse hippocampique adulte. Avec cette méthode, il est possible d’adapter le choix de l’anticorps dans le gating FACS, ce qui rend ce protocole très polyvalent pour répondre à diverses questions biologiques liées au gyrus denté. Cette méthode est principalement conçue pour étudier la niche hippocampique adulte.
Cependant, il pourrait facilement être adapté pour étudier d’autres niches de cellules souches. Sara Ahmed de Prado, boursière de formation postdoctorale à l’Institut Francis Crick, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, transférez le cerveau disséqué de la souris euthanasiée dans une boîte de Pétri de 10 centimètres remplie de PBS glacé.
Ensuite, placez la boîte de Petri sur de la glace et coupez le cerveau en deux moitiés le long de l’axe sagittal. À l’aide d’un scalpel, retirez le cervelet. Transférez la moitié du cerveau dans la nouvelle boîte de Petri de 10 centimètres placée sur de la glace, contenant du PBS glacé.
Disséquez le gyrus denté, ou DG, à l’aide de jumelles, et répétez cette étape pour obtenir le deuxième DG de la seconde moitié du cerveau. Transférez les deux DG dans l’homogénéisateur Dounce pré-refroidi et ajoutez 1 millilitre de tampon d’homogénéisation à froid, ou HB. Homogénéiser le tissu avec 10 coups du pilon A lâche, suivis de 15 coups du pilon B serré. Transférer l’homogénat dans un tube prérefroidi de 15 millilitres.
Rincez l’homogénéisateur Dounce avec 1 millilitre de HB froid et combinez-le avec le même tube. Ajouter 3 millilitres de HB dans le tube de 15 millilitres et incuber pendant 5 minutes sur de la glace. Mélangez deux fois cette suspension de noyaux en inversant doucement le tube.
En utilisant 0,5 millilitre de HB, pré-mouiller le capuchon de la crépine de 70 micromètres placé sur un tube à essai de 50 millilitres, puis filtrer la suspension de noyaux avant de laver la crépine cellulaire avec 0,5 millilitre de HB. Ensuite, retirez la crépine cellulaire et centrifugez le tube à essai dans une centrifugeuse à godet pivotant à 500 x g pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius. Jetez le surnageant. Remettez doucement la pastille en suspension dans 4 millilitres de HB à l’aide d’une pipette P1000.
Après 5 minutes d’incubation sur glace, centrifuger la suspension à 500 x g pendant 10 minutes, à 4 degrés Celsius. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 3 millilitres de produit de lavage. Utilisez 0,5 millilitre de produit de lavage pour prémouiller un bouchon de crépine de 35 micromètres sur un tube à essai de 50 millilitres.
Ensuite, filtrez la suspension des noyaux en pipetant 0,5 millilitre de suspension à la fois, à l’aide d’une pipette P1000. Après avoir lavé le bouchon de la crépine avec 0,5 millilitre de produit de lavage, placez le tube sur de la glace. Transférer le filtrat dans un nouveau tube de 15 millilitres et le centrifuger pendant 5 minutes et 4 degrés Celsius, à 500 x g.
Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 3 millilitres de produit de lavage. Répétez la centrifugation et remettez la pastille en suspension dans 1 millilitre de produit de lavage avec l’anticorps anti-NeuN de souris, l’anticorps conjugué Alexa Fluor 488 et 1 microgramme par millilitre DAPI. Incuber la réaction pendant 45 minutes sur de la glace dans l’obscurité.
Pour le tri des noyaux activés par fluorescence, ou FANS, transférer la suspension de noyaux immunocolorés dans un tube à essai de 5 millilitres et la placer sur de la glace jusqu’au début de la procédure de cytométrie en flux. Vortex les échantillons pendant 3 secondes, avec une intensité légère, avant de placer les tubes dans l’instrument FACS. Pour acquérir les données à partir de noyaux colorés en suspension, réglez les portes en hauteur DAPI et en zone DAPI pour exclure les débris cellulaires et les noyaux agrégés.
Placez ensuite les portes dans la zone de diffusion côté log, ou SSC, et dans la zone de diffusion logarithmique directe, ou FSC, pour séparer les noyaux simples des agrégats colorés DAPI restants ou des débris cellulaires. Isolez ensuite la population négative de NeuN-AF488 en définissant les portes de la zone anti-NeuN-AF488 et FSC. Après l’analyse, triez la population négative anti-NeuN-AF488 dans un tube de collecte de 1,5 millilitre rempli de 50 microlitres de média de lavage en utilisant la stratégie de contrôle.
Une fois le tri terminé, ajouter 1 millilitre de PBS contenant 1% d’albumine sérique bovine, ou BSA, au tube de collecte pour recueillir les gouttelettes de la paroi du tube et centrifuger le tube à 500 x g, pendant 5 minutes, à 4 degrés Celsius. Jeter le surnageant, en laissant 50 microlitres de soluté pour remettre en suspension les noyaux centrifugés. Dans un microtube de 0,5 millilitre, ajoutez 5 microlitres de la suspension de noyaux à 5 microlitres de bleu de trypan.
Mesurer la concentration et évaluer la viabilité de la suspension unicellulaire à l’aide d’un compteur de cellules automatisé avant d’effectuer la préparation de la bibliothèque et le séquençage des noyaux. Le regroupement bioinformatique a révélé des groupes de noyaux bien séparés correspondant à des types cellulaires connus au sein du DG, avec ou sans FANS. Dans l’échantillon non trié par FACS, la plupart des noyaux séquencés de haute qualité représentaient 84,9% des neurones.
Il comprenait trois groupes de neurones, indiquant la possibilité que les populations cellulaires les plus représentatives du gyrus denté soient des neurones granulaires, d’autres neurones excitateurs et des neurones inhibiteurs. Dans l’échantillon non trié par FACS, les amas non neuronaux identifiés étaient principalement constitués de 11,1% de types de cellules gliales, y compris des astrocytes, des oligodendrocytes et des cellules précurseurs d’oligodendrocytes, 3,3% de cellules immunitaires et 0,6% de cellules Cajal-Retzius. Lors de l’exécution de FANS pour exclure les populations positives NeuN, les amas de cellules gliales sont devenus proéminents, avec 81,3% des noyaux totaux.
Pour les échantillons séquencés à 50 000 lectures par noyau, 25 010 gènes ont été détectés par noyau pour l’échantillon non trié par FACS, et 1 665,5 gènes pour l’échantillon FANS négatif NeuN, confirmant que le profilage transcriptomique de haute qualité des noyaux uniques et le tri FACS n’endommagent pas les noyaux pour le séquençage ultérieur de l’ARNsn. La forte proportion de neurones dans l’échantillon non trié par FACS avait une activité transcriptionnelle plus élevée de 2 660 gènes par noyau et 6 170 transcrits par noyau dans l’échantillon non trié par FACS que les types de cellules non neuronales avec une activité transcriptionnelle moyenne de 1 090 gènes par noyau et 1 785 transcrits par noyau. Une fois les données générées avec ce protocole, il vaut la peine d’envisager ces nouvelles méthodes orthogonales telles que des symptômes spéciaux ou des études in vivo pour valider les résultats.
