Les auteurs apprécient les conseils et l&#39;appui technique fourni par le Dr Richard Konz et personnel de l&#39;établissement de base de cytométrie en flux à l&#39;Université du Massachusetts Medical School. Les ressources de base soutenu par le diabète de recherche en endocrinologie Centre DK032520 Grant ont également été utilisés. Ce travail est soutenu par des subventions de l&#39;Institut national de santé mentale (NIMH), le National Institute of Drug Abuse (NIDA) et l&#39;Institut national de la santé infantile et du développement humain.

Extraction des noyaux <ol><li> Mettez 250 mg de tissus post-mortem du cerveau congelé dans 5 mL 1 Lysis Buffer dans un douncer et le placer sur la glace. Pour recevoir environ 5 millions de noyaux après la FACS tri, nous utilisons habituellement 1000 mg de tissu par exemple. </li><li> Une fois le tissu a été décongelé, le tissu Dounce pendant 1 minute tout sur la glace. </li><li> Prenez le tissu homogénéisé et le placer dans un tube de 15 ml ultracentrifugeuse clair. Placer le tube sur la glace. </li><li> Prenez 9 ml de 2 Solution Sucrée avec une pipette, mettre la pipette au fond du tube d&#39;ultracentrifugation clair, et la libération de la Solution 2 Saccharose de créer un gradient de concentration avec la solution de tissu homogénéisé sur le dessus de la Solution 2 saccharose. </li><li> Peser les tubes d&#39;ultracentrifugation pour s&#39;assurer qu&#39;ils seront tous équilibrée tout en tournant dans le ultracentrifugation. Faites les ajustements à la masse en ajoutant 1 tampon de lyse de la couche supérieure. </li><li> Après les tubes ont été pesés, les placer dans des seaux du rotor. </li><li> Placez tous les godets dans un rotor SW28 et placer soigneusement le rotor dans le ultracentrifugation. </li><li> Ultracentrifuger les échantillons à 107163,6 RCF pendant 2,5 heures à 4 ° C. </li><li> Une fois la centrifugation est terminée, retirez le surnageant, le long de la couche de débris trouvés au gradient de concentration, avec l&#39;utilisation d&#39;un vide, tout en faisant attention à ne pas perturber le culot contenant les noyaux au fond du tube. </li><li> Ajouter 500 ul de PBS 1X à chaque pastille et laisser reposer sur la glace pendant 20 minutes. Cela permet à la pastille à dissoudre un peu sur ses propres, ce qui rend plus facile à plus tard, mécaniquement dissoudre par aspiration et refoulement, ce qui diminue la quantité de stress de l&#39;expérience des noyaux. </li><li> Après les noyaux ont incubé sur la glace pendant 20 minutes, mécaniquement pipette haut et en bas afin de dissoudre complètement les noyaux au sein 1XPBS. </li><li> Retirer la solution noyaux contenant des tubes d&#39;ultracentrifugation et de combiner le contenu de deux tubes en un seul tube de 2 ml microtubes. Encore une fois, placer les échantillons sur la glace. </li></ol> Immunocoloration pour FACS <ol><li> À ce stade, faire un mélange composé immunomarquage de l&#39;anticorps primaire et secondaire, et le blocage Mix. Pour chaque échantillon, mélanger 300 pi de 1XPBS contenant 1,2 uL d&#39;anticorps NeuN, 100 ul de Mix de blocage, qui contient 0,5% de BSA et 10% sérum de chèvre normal dans 1XPBS, et 1 ul de Alexa Fluor 488. Pour les échantillons de contrôle, d&#39;exclure l&#39;NeuN anticorps primaire et, au contraire, il suffit d&#39;ajouter 1XPBS. </li><li> Vortex le mélange immunomarquage et incuber pendant 5 minutes à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Pendant que le mélange de coloration est en incubation, rendre les contrôles pour les échantillons. Pour FACS de tri, un échantillon contenant des noyaux seul, appelé le «contrôle sans tache» est nécessaire, un deuxième échantillon, un contrôle négatif, contenant des noyaux avec l&#39;anticorps secondaire Alexa Fluor 488 sans NeuN anticorps primaire est également nécessaire. </li><li> Aliquote de 20 uL des noyaux contenant une solution dans un tube à centrifuger 2 ml contenant 1XPBS pour le contrôle sans tache, et un autre 20 uL dans un autre tube de 2 ml contenant 980 ul de 1XPBS pour le contrôle négatif. Augmentez le volume de l&#39;échantillon contenant des noyaux de retour jusqu&#39;à 1 mL avec 1XPBS. Tous les échantillons sont placés dos à la glace. </li><li> Maintenant que le mélange immunomarquage a terminé l&#39;incubation, ajouter son contenu de 401 uL dans les échantillons appropriés. L&#39;échantillon noyaux recevront le mélange contenant les deux NeuN et Alexa Fluor 488, tandis que l&#39;échantillon négatif recevront le mélange ne contenant l&#39;anticorps secondaire Alexa Fluor 488. </li><li> Prélever les échantillons dans la chambre froide pour tourner dans l&#39;obscurité pendant 45 minutes. </li><li> Après les échantillons ont incubé dans l&#39;obscurité pendant 45 minutes, les mettre sur la glace et les amener à l&#39;installation de FACS. Pendant le transport à l&#39;installation de FACS, les échantillons doivent être conservés sur la glace et dans l&#39;obscurité. </li></ol> FACS <ol><li> À l&#39;installation FACS, filtrer les échantillons à travers un filtre 40 um. Ensuite, les faire fonctionner grâce à l&#39;instrument pendant quelques minutes, tout en étant conservés au froid, afin d&#39;obtenir certaines données préliminaires avant le tri. </li><li> À ce stade, il est nécessaire de mettre les portes appropriées requises pour le tri. Plusieurs portes sont utilisés pour des échantillons de tri. La première porte donne une idée de la taille des différents noyaux trouvés dans l&#39;échantillon, et permet separatation des débris de noyaux réels. La deuxième porte nous permet de trier les noyaux individuellement. Jeter tout agrégats sont rejetées à ce stade. Enfin, la troisième porte est fixé à une longueur d&#39;onde spécifique de fluorescence, correspondant à celle du fluorochrome trouve dans nos anticorps secondaire. Placer cette porte nous permet de trier et de + NeuN séparées, donc les noyaux des neurones à partir NeuN - noyaux. </li><li> Après toutes les portes sont choisis, les noyaux peuvent être classés en 1XPBS. </li><li> Une fois leensemble de l&#39;échantillon a traversé, vérifier la pureté de la sorte en exécutant une aliquote de l&#39;échantillon trié à travers l&#39;instrument. Assurez-vous que la fluorescence de l&#39;échantillon n&#39;est pas étalé, mais plutôt est contenue dans un seul quadrant. Il est préférable de choisir des échantillons qui sont plus de 90% pur. </li></ol> Après FACS <ol><li> Une fois l&#39;échantillon a été trié, le traitement des noyaux peut commencer. Prélever 10 ml de l&#39;échantillon trié et y ajouter 2 mL de 2 Solution Sucrée, 50 ul de CaCl 2 1M et 30 ul de 1m Mg (Ace) 2. Pour rappel, toujours être sûr de garder l&#39;échantillon sur la glace depuis les noyaux sont non fixées. </li><li> S&#39;il ya moins de 10 mL d&#39;échantillon trié, augmenter le volume jusqu&#39;à 10 ml en ajoutant 1XPBS, ou ajuster le matériel supplémentaire en conséquence. </li><li> Inverser l&#39;échantillon plusieurs fois et placer sur la glace pendant 15 minutes. </li><li> Après les échantillons ont incubé sur la glace pendant 15 minutes, les centrifugeuses dans un rotor à godets balancer à 1786 RCF pendant 15 minutes à 4 ° C. </li><li> Jeter le surnageant à l&#39;utilisation d&#39;un vide, sans perturber le culot blanc trouvé au fond du tube. </li><li> Dissoudre le culot dans 200 pi de toute solution dont vous avez besoin pour les expériences de procédure, et la pipette de haut en bas. </li><li> Transférer la solution dans un petit tube et le placer dans le congélateur à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation ultérieure. </li></ol>

<ol>
	<li>Siegmund, K. D., Connor, C. M., Campan, M., Long, T. I., Weisenberger, D. J., Biniszkiewicz, D., Jaenisch, R., Laird, P. W., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+the+human+cerebral+cortex+is+dynamically+regulated+throughout+the+life+span+and+involves+differentiated+neurons.">DNA methylation in the human cerebral cortex is dynamically regulated throughout the life span and involves differentiated neurons.</a> PLoS ONE. 2, 895-895 (2007).</li><li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue.">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).</li><li>Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans.">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122, 133-143 (2005).</li><li>Acevedo, L. G., Iniguez, A. L., Holster, H. L., Zhang, X., Green, R., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+ChIP-chip+analysis+using+10,000+human+cells.">Genome-scale ChIP-chip analysis using 10,000 human cells.</a> Biotechniques. 43, 791-797 (2007).</li></ol>

Le protocole présenté ici devrait être particulièrement utile pour les études ont porté sur les modifications épigénétiques de la chromatine neuronale et, plus généralement, sur le phénotype moléculaire du noyau des neurones, au cours normal de la maladie neurologique ou psychiatrique en développement et le vieillissement, ou dans. La méthode est particulièrement avantageuse lorsque l&#39;hétérogénéité cellulaire des tissus du cerveau, y compris d&#39;éventuelles modifications dans le neurone-glie à la ration au cours...

Réactifs: <table><tr><th colspan="3" align="left"> 1. Lysis Buffer </th></tr><tr><td> 0,32 M </td><td> Saccharose </td><td> 5,47 g </td></tr><tr><td> 5 mM </td><td> CaCl 2 </td><td> 250 pi </td></tr><tr><td> 3 mM </td><td> Mg (acétate) 2 </td><td> 150 ul </td></tr><tr><td> 0,1 mM </td><td> EDTA </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> 10mM </td><td> Tris-HCl, pH8 </td><td> 500 pi </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> TNT </td><td> 17 ul </td></tr><tr><td> 0,1% </td><td> Triton X-100 </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Réglez le volume à 50 ml avec de l&#39;eau à l&#39;autoclave </td></tr></table><table><tr><th colspan="3" align="left"> 2. Solution Sucrée </th></tr><tr><td> 1,8 M </td><td> Saccharose </td><td> 30,78 g </td></tr><tr><td> 3 mM </td><td> Mg (acétate) 2 </td><td> 150 ul </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> TNT </td><td> 17 ul </td></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris-HCl, pH8 </td><td> 500 pi </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Réglez le volume à 50 ml avec de l&#39;eau à l&#39;autoclave </td></tr></table><table><tr><th colspan="3" align="left"> 3. Dounce tampon </th></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris </td><td> 0,242 g </td></tr><tr><td> 4 mM </td><td> MgCl 2 </td><td> 0,163 g </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> CaCl 2 </td><td> 0,03 g </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Ajuster le pH à 7,5 et le volume à 200 ml avec de l&#39;eau à l&#39;autoclave </td></tr></table>

neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue

Les neurones dans le cerveau humain devient postmitotiques largement au cours du développement prénatal, et donc de maintenir leurs noyaux à travers la pleine durée de vie. Cependant, on sait peu de changements dans la chromatine neuronale et l&#39;organisation nucléaire au cours du développement et de vieillissement, ou dans la maladie neuropsychiatrique chronique. Toutefois, à ce jour la plupart des dosages d&#39;ADN de la chromatine et basée (autres que les poissons) la résolution de cellules manquent unique. À cette fin, l&#39;hétérogénéité cellulaire du tissu cérébral constitue une limitation importante, parce que les sous-populations différentes de neurones normalement sont mêlés à différents types de cellules gliales et les autres cellules non-neuronales. Une solution possible serait de développer un type de cellule cultures spécifiques, mais la plupart des cellules du SNC, y compris les neurones, sont ex vivo durable, au mieux, pour seulement quelques semaines et ne serait donc fournir un modèle incomplet pour des mécanismes épigénétiques pourraient exploitation à travers la pleine durée de vie . Ici, nous fournissons un protocole pour extraire et purifier les noyaux de surgelés (jamais fixe) du cerveau post-mortem humain. La méthode consiste à l&#39;extraction de noyaux dans un tampon de lyse hypotonique, suivie par ultracentrifugation et immunotagging avec des anti-NeuN anticorps. Étiqueté noyaux des neurones sont ensuite collectés séparément en utilisant la fluorescence-activated tri. Cette méthode devrait être applicable à n&#39;importe quelle région du cerveau dans une large gamme d&#39;espèces et propice aux études d&#39;immunoprécipitation de chromatine avec des sites et la modification spécifique des anticorps anti-histones et la méthylation de l&#39;ADN et autres tests.

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Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

L&#39;hétérogénéité cellulaire du tissu cérébral constitue une limitation importante pour l&#39;étude des marqueurs épigénétiques de la chromatine, car la plupart des essais n&#39;ont pas la résolution seule cellule. Les neurones sont généralement mêlés à des cellules gliales et les autres cellules non-neuronales. Nous fournissons un protocole pour extraire et collecter des noyaux des neurones du cerveau humain.

Isolement des noyaux neuronaux à partir de tissus post-mortem du cerveau de l&#39;homme

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

neuronal-nuclei-isolation-from-human-postmortem-brain-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

22.0K vues.  University of Massachusetts Medical School. L'hétérogénéité cellulaire du tissu cérébral constitue une limitation importante pour l'étude des marqueurs épigénétiques de la chromatine, car la plupart des essais n'ont pas la résolution seule cellule. Les neurones sont généralement mêlés à des cellules gliales et les autres cellules non-neuronales. Nous fournissons un protocole pour extraire et collecter des noyaux des neurones du cerveau humain.

Vidéo: Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental factors that might result in epigenetic alterations of gene expression and other molecular pathology. Traditionally, however, expression studies in postmortem brain were confined to quantification of mRNA or protein. The limitations encountered in postmortem brain research   such as variabilities in autolysis time and tissue integrities   are also likely to impact any studies of higher order chromatin structures. However, the nucleosomal organization of genomic DNA   including DNA:core histone binding - appears to be largely preserved in representative samples provided by various brain banks. Therefore, it is possible to study the methylation pattern and other covalent modifications of the core histones at defined genomic loci in postmortem brain. Here, we present a simplified native chromatin immunoprecipitation (NChIP) protocol for frozen (never-fixed) human brain specimens. Starting with micrococcal nuclease digestion of brain homogenates, NChIP followed by qPCR can be completed within three days. The methodology presented here should be useful to elucidate epigenetic mechanisms of gene expression in normal and diseased human brain.

Until recently, expression studies on human brain were limited to quantification of RNA or protein. With the chromatin immunoprecipitation techniques described in this paper, it will be possible to map histone methylation and other epigenetic regulators of gene expression in postmortem brain.

Un dosage de la chromatine pour les tissus du cerveau humain

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Recherche

Biologie

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression profiles of pyramidal neurons in layer III. It is well known that the cerebral cortex is an exceptionally heterogeneous structure comprising diverse regions, layers and cell types, each of which is characterized by distinct cellular and molecular compositions and therefore differential gene expression profiles. To circumvent the confounding effects of tissue heterogeneity, we used laser-capture microdissection (LCM) in order to isolate our specific cell-type i.e pyramidal neurons.
Approximately 500 pyramidal neurons stained with the Histogene staining solution were captured using the Arcturus XT LCM system. RNA was then isolated from captured cells and underwent two rounds of T7-based linear amplification using Arcturus/Molecular Devices kits. The Experion LabChip (Bio-Rad) gel and electropherogram indicated good quality a(m)RNA, with a transcript length extending past 600nt required for microarrays. The amount of mRNA obtained averaged 51&mu;g, with acceptable mean sample purity as indicated by the A260/280 ratio, of 2.5. Gene expression was profiled using the Human X3P GeneChip probe array from Affymetrix.

We describe a process using laser-capture microdissection to isolate and extract RNA from a homogeneous cell population, pyramidal neurons, in layer III of the superior temporal gyrus in postmortem human brains. We subsequently linearly amplify (T7-based) mRNA, and hybridize the sample to the Affymetrix human X3P microarray.

Obtention d&#39;ARN de haute qualité provenant des populations cellule unique de tissus post-mortem du cerveau de l&#39;homme

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Isolation des myofibroblastes primaires de souris et de tissus du côlon humain

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension with&#160;intact cell or nuclei involves dissociation and permeabilization, steps that can introduce unwanted noise and undesirable damage. Particularly, certain cell-types such as neurons are challenging to dissociate into individual cells. Additionally, permeabilization of the cellular membrane to release nuclei requires optimization by trial-and-error, which can be time consuming, labor intensive and financially nonviable. To enhance the robustness and reproducibility of sample preparation for high-throughput sequencing, we describe a rapid enzyme and detergent-free column-based nuclei isolation method. The protocol enables efficient isolation of nuclei from the entire zebrafish brain within 20 minutes. The isolated nuclei display intact nuclear morphology and low propensity to aggregate. Further, flow cytometry allows nuclei enrichment and clearance of cellular debris for downstream application. The protocol, which should work on soft tissues and cultured cells, provides a simple and accessible method for sample preparation that can be utilized for high-throughput profiling, simplifying the steps required for successful single-nuclei RNA-seq and ATAC-seq experiments.

Single nuclei isolation relies on dissociation and detergent-based permeabilization of the cell membrane, steps that need optimization and are prone to introducing technical artifacts. We demonstrate a detergent and enzyme-free protocol for rapid isolation of intact nuclei directly from whole tissue, yielding nuclei suitable for single-nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) or ATAC-seq.

Isolation des noyaux par tissu entier à l’aide d’une méthode sans détergent et sans enzymes

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

Isolement de noyaux à partir de reins de souris adultes pour le séquençage de l’ARN mononucléaire

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological regulators of organismal homeostasis and important indicators of pathologies; in the meantime, their immense potential to establish accessible and controllable disease therapeutics is emerging. Mesenchymal stem cells (MSCs) can release large amounts of EVs in culture, which have shown promise to jumpstart effective tissue regeneration and facilitate extensive therapeutic applications with good scalability and reproducibility. There is a growing demand for simple and effective protocols for collecting and applying MSC-EVs. Here, a detailed protocol is provided based on differential centrifugation to isolate and characterize representative EVs from cultured human MSCs, exosomes, and microvesicles for further applications. The adaptability of this method is shown for a series of downstream approaches, such as labeling, local transplantation, and systemic injection. The implementation of this procedure will address the need for simple and reliable MSC-EVs collection and application in translational research.

The present protocol describes the differential centrifugation for isolating and characterizing representative EVs (exosomes and microvesicles) from cultured human MSCs. Further applications of these EVs are also explained in this article.

Isolement, caractérisation et application thérapeutique de vésicules extracellulaires à partir de cellules souches mésenchymateuses humaines en culture

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

Isolation of Nuclei from Flash-Frozen Liver Tissue for Single-Cell Multiomics

The liver is a complex and heterogenous tissue responsible for carrying out many critical physiological functions, such as the maintenance of energy homeostasis and the metabolism of xenobiotics, among others. These tasks are performed through tight coordination between hepatic parenchymal and non-parenchymal cells. Additionally, various metabolic activities are confined to specific areas of the hepatic lobule-a phenomenon called liver zonation. Recent advances in single-cell sequencing technologies have empowered researchers to investigate tissue heterogeneity at a single-cell resolution. In many complex tissues, including the liver, harsh enzymatic and/or mechanical dissociation protocols can negatively affect the viability or the quality of the single-cell suspensions needed to comprehensively characterize this organ in health and disease.
This paper describes a robust and reproducible protocol for isolating nuclei from frozen, archived liver tissues. This method yields high-quality nuclei that are compatible with downstream, single-cell omics approaches, including single-nucleus RNA-seq, assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq), as well as multimodal omics (joint RNA-seq and ATAC-seq). This method has been successfully used for the isolation of nuclei from healthy and diseased human, mouse, and non-human primate frozen liver samples. This approach allows the unbiased isolation of all the major cell types in the liver and, therefore, offers a robust methodology for studying the liver at the single-cell resolution.

Here, we present a protocol for isolating nuclei from flash-frozen, archived liver tissues for single-nucleus RNA-seq, ATAC-seq, and joint multiomics (RNA-seq and ATAC-seq).

Isolement de noyaux de tissu hépatique surgelé pour la multiomique unicellulaire

The liver is a complex and heterogenous tissue responsible for carrying out many critical physiological functions, such as the maintenance of energy ...

Isolement et profilage de noyaux uniques à partir de tissus de mammifères congelés

A Simple, Quick, and Partially Automated Protocol for the Isolation of Single Nuclei from Frozen Mammalian Tissues for Single Nucleus Sequencing

Single-cell and single-nucleus RNA sequencing have become common laboratory applications due to the wealth of transcriptomic information that they provide. Single nucleus RNA sequencing, particularly, is useful for investigating gene expression in difficult-to-dissociate tissues. Furthermore, this approach is also compatible with frozen (archival) material. Here, we describe a protocol to isolate high-quality single nuclei from frozen mammalian tissues for downstream single nucleus RNA sequencing in a partially-automated manner using commercially available instruments and reagents. Specifically, a robotic dissociator is used to automate and standardize tissue homogenization, followed by an optimized chemical gradient to filter the nuclei. Lastly, we accurately and automatically count the nuclei using an automated fluorescent cell counter. The performance of this protocol is demonstrated on mouse brain, rat kidney, and cynomolgus liver and spleen tissue. This protocol is straightforward, rapid, and readily adaptable to various mammalian tissues without requiring extensive optimization and provides good quality nuclei for downstream single nuclei RNA sequencing.

Pleins feux sur l’auteur : Améliorer la découverte de médicaments - Développement de protocoles automatisés et standardisés pour l’extraction de noyaux à partir de tissus congelés 

The study describes a simple, quick, and partially automated protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mammalian tissues for downstream single nuclei RNA sequencing.

Un protocole simple, rapide et partiellement automatisé pour l’isolement de noyaux uniques à partir de tissus de mammifères congelés pour le séquençage d’un seul noyau