L’aneuploïdie est la principale cause génétique de fausse couche précoce chez l’homme. La plupart des erreurs dans la ségrégation chromosomique se produisent pendant la méiose dans les ovocytes. Par conséquent, l’évaluation du point de contrôle de l’assemblage du fuseau dans les ovocytes est essentielle pour comprendre pourquoi les ovocytes sont sujets aux erreurs.
Nous décrivons ici trois techniques pour évaluer de manière exhaustive l’intégrité des SAC dans les ovocytes de souris en examinant différentes étapes critiques au point de contrôle en utilisant une combinaison d’imagerie en direct et d’immunofluorescence. La démonstration de la procédure sera assurée par la Dre Cecilia Blengini, associée de recherche de mon laboratoire. Pour commencer, préparer un millilitre de milieu de culture contenant du nocodazole et de la réversine avec du DMSO comme témoin, comme décrit dans le manuscrit.
Pour la maturation ovocytaire et l’imagerie en direct, utilisez une plaque préchauffée de 96 puits dans un incubateur. Et chargez le premier, le deuxième et le troisième puits avec 150 microlitres de DMSO témoin, de nocodazole et de nocodazole plus traitement par réversine respectivement. Tout en conservant la plaque dans l’incubateur dans les conditions décrites dans le manuscrit.
Pour commencer la maturation myotique, retirez la milrinone en transférant séquentiellement les ovocytes à travers 6 gouttes de 100 microlitres de milieux de culture sans milrinone contenant du DMSO. Et placez-les dans le puits correspondant de la plaque de 96 puits. Utiliser une pipette manuelle ou buccale tout en observant les ovocytes au microscope.
Imagez les ovocytes à l’aide d’un microscope à fond clair équipé d’une chambre d’incubateur avec un environnement contrôlé à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone et 80% d’humidité. Prenez des images au plan médian des ovocytes à des intervalles de 20 minutes pendant 24 heures. Après avoir quantifié le nombre d’ovocytes qui extrudent un corps polaire en identifiant les cellules qui passent par des cytokines asymétriques avec une petite cellule à côté de l’œuf et dans la zone pellucide partagée.
Visualisez les images à l’aide d’un logiciel d’imagerie. Microinjecter des ovocytes arrêtés de phase un avec 100 nanogrammes par microlitre d’ARNc securine-gfp préalablement préparé. Après la micro-injection, laissez les ovocytes récupérer et traduisez l’ARN dans l’incubateur de dioxyde de carbone pendant au moins trois heures.
Ensuite, chargez 150 microlitres de milieux de culture avec ou sans cinq micromolaires de nocodazole. Et 150 microlitres de milieux de culture avec 0,5 micromolaire de réversine dans trois puits différents d’une plaque de 96 puits. Laver les ovocytes micro-injectés à travers six gouttes de milieux de culture sans milrinone et transférer un tiers des ovocytes dans chaque traitement.
Gardez la plaque dans l’incubateur à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone et 80% d’humidité jusqu’à ce que les ovocytes reprennent la méiose, environ trois heures après le lavage de la milrinone. Enregistrez des images de la maturation des ovocytes à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’une chambre d’incubateur. Utilisez un logiciel d’analyse d’images pour quantifier la destruction de la sécurité gfp et ouvrez les images du canal GFP, à partir du temps 0.1.
Dans le logiciel d’analyse préféré, utilisez l’outil de sélection ou de forme pour marquer chaque ovocyte et générer une région d’intérêt pour chaque cellule. Utilisez la même région d’intérêt pour sélectionner une zone d’arrière-plan à soustraire ultérieurement et mesurer l’intensité des pixels GFP dans chaque région d’intérêt à tous les points temporels. Enfin, à chaque valeur GFP, soustrayez la mesure de la région d’intérêt en arrière-plan.
Après avoir divisé la méiose en trois groupes, transférer chaque groupe de méiose dans des gouttes de 100 microlitres de milieux de culture sans milrinone. Couvrez les gouttes d’huile minérale et placez-les dans l’incubateur pendant trois, cinq et sept heures pour atteindre respectivement la première phase de prométaphase, la première phase de prométaphase tardive et la première phase de métaphase. Aux points de temps assignés, fixez les ovocytes en les transférant dans des gouttes de 500 microlitres de paraformaldéhyde à 2% dans un tampon PME pendant 20 minutes à température ambiante à l’aide d’un plat en verre à neuf puits.
Ensuite, transférez les cellules dans un puits propre contenant une goutte de 500 microlitres de solution bloquante. Pour poursuivre la détection MAD2, transférer les ovocytes dans un puits propre contenant une goutte de 500 microlitres de solution de perméabilisation. Après avoir incubé pendant 20 minutes à température ambiante, transférer les cellules dans un nouveau puits de solution de blocage et incuber pendant 10 minutes.
Transférer les ovocytes dans une goutte de 30 microlitres de solution bloquante avec anticorps anti-MAD2 et anticorps anti-centromère et incuber pendant deux heures à température ambiante. Pour laver l’excès d’anticorps primaires après transfert des cellules dans 30 microlitres, goutte de tampon PME supplémentée en 0,5% de Triton, incuber pendant 10 minutes dans la chambre humidifiée. Transférer les cellules dans une goutte de 30 microlitres de solution bloquante contenant des anticorps secondaires tels que l’anti-humain 633 et l’anti-lapin 568.
Et incuber pendant une heure à température ambiante. Pour monter les cellules sur la lame du microscope, transférez les cellules dans une goutte de 10 microlitres de support de montage contenant du DAPI. Ajoutez de petits points de vaseline à chaque coin du couvercle.
Placez-les délicatement sur la goutte de support de montage et appuyez lentement pour distribuer. Scellez le couvercle à la glissière à l’aide de vernis à ongles transparent. Image des kinétochores à l’aide d’un microscope confocal équipé d’un objectif 40 ou 63 X.
Et en utilisant le signal d’anticorps anti-centromère, déterminez la gamme Z qui permet l’imagerie de toute la zone chromosomique. Les ovocytes témoins traités par DMSO ont extrudé un corps polaire environ 14 heures après la libération de la milrinone. Après l’activation du SAC, les ovocytes traités au nocodazole ont été arrêtés dans la première métaphase et n’ont pas extrudé un corps polaire.
Cependant, en l’absence d’activation du SAC, les ovocytes ont extrudé un corps polaire malgré l’absence de fixations de microtubules kinétochore . Le taux de dégradation de la securine-gfp au cours de la maturation myotique a été évalué. Dans laquelle l’intensité de la sécurine-gfp des ovocytes traités par le DMSO témoin commence à diminuer environ 10 heures après le lavage de la milrinone.
Lorsque les ovocytes ont mûri en présence de l’agent activateur SAC, le nocodazole, les taux de securine-gfp étaient stables pendant toute la période de maturation myotique. En revanche, lors de la prévention de l’activation du SAC avec un traitement réversine, le schéma securine-gfp s’est accéléré et la dégradation a commencé environ quatre heures après le lavage de milrinone, ce qui correspond à une inhibition de la SAC. L’imagerie confocale a été utilisée pour détecter les centromères et MAD2 des ovocytes matures au début de la prométaphase un, à la prométaphase tardive un et à la métaphase un.
Pour évaluer la force du signal SAC, l’intensité de pixel MAD2 localisée par kinétochore a été quantifiée. Des niveaux significatifs de recrutement de MAD2 dans les kinétochores se produisent au début de la première phase de prométaphase, lorsque la plupart des kinétochores n’étaient pas attachés aux microtubules. Les niveaux de MAD2 ont diminué dans la prométaphase ultérieure et étaient presque absents à la première métaphase lorsque toutes les kinétochores étaient fixées de manière stable aux microtubules.
Il est important de souligner que chacune de ces techniques a ses limites et son interprétation. Et nous suggérons d’effectuer une combinaison de ces méthodes pour évaluer l’intégrité du SAC. Ces trois essais permettent aux chercheurs d’évaluer la rigueur du sac dans les ovocytes en donnant un aperçu d’une cause potentielle d’aneuploïdie dans les ovules humains.
