L’objectif global de ce protocole est de présenter une méthode optimisée pour l’isolement des hépatocytes chez la souris après hépatectomie partielle sans avoir besoin de centrifugation par gradient de densité. Nous voyons généralement un pourcentage élevé d’hépatocytes chargés de lipides au cours de la régénération précoce. Les hépatocytes stéatotiques habituellement perdus lors de la centrifugation du gradient de densité en raison de la faible densité sont conservés avec ce protocole.
Pour préparer l’équipement de perfusion, connectez une canule IUI de calibre 26 à l’extrémité de sortie du tube à l’aide d’un connecteur Luer Lock. Ensuite, rincez le tube et insérez l’extrémité d’entrée du tube dans le tube tampon de perfusion préchauffé au bain-marie. Amorcez-le avec un tampon de perfusion chaud à une vitesse de pompe de trois millilitres par minute.
Avant de procéder à la chirurgie, assurez-vous que la souris est correctement anesthésiée. Nettoyez ensuite l’abdomen avec une solution de gommage chirurgical et de l’éthanol à 70%. Ensuite, coupez les sutures pour rouvrir l’incision médiane précédemment faite pour l’hépatectomie partielle et écartez doucement les bords de la plaie.
Si l’hépatectomie date de plus de 24 à 48 heures, retirez la suture et coupez la peau avec des ciseaux ou un scalpel. Utilisez un rétracteur ou de simples clips pour garder l’abdomen ouvert. La cavité abdominale doit être exposée autant que possible pour optimiser l’accès et la visualisation.
Fixez une suture en polypropylène 5-0 au sternum. Tirez-le crânienne et fixez-le dans cette position. Déplacez les intestins vers la droite à l’aide de cotons-tiges stériles pour révéler la veine porte et la veine cave.
Utilisez un chiffon humide pour retenir les intestins. Placez un objet lourd d’environ deux centimètres de hauteur, tel qu’un anneau de poids en métal adjacent aux pattes postérieures de la souris. Ensuite, placez le tube avec la canule IUI de calibre 26 connectée sur l’objet et positionnez soigneusement l’aiguille sur le dessus de la veine cave.
Ajustez la longueur du tube au besoin. Transférer la solution mère de collagénase dans le tube tampon de digestion préchauffé. Préparez 10 à 20 millilitres de tampon de digestion par animal.
Allumez la pompe après avoir réglé la vitesse de la pompe à trois millilitres par minute. Jetez les deux à trois premiers millilitres du tampon de perfusion préchauffé une fois que le tampon atteint l’aiguille. Pour effectuer la canulation de la veine cave inférieure, utilisez un coton-tige stérile pour tirer doucement la veine cave caudale sous la ponction afin que la tension fournie facilite l’insertion de la canule dans la veine.
Insérez la canule IUI de calibre 26 à un angle peu profond dans la veine cave inférieure sous le rein pendant que le tampon traverse l’aiguille. Assurez-vous que le biseau de l’aiguille pointe vers le haut. Recherchez du sang dans la chambre flash du cathéter lorsque l’aiguille pénètre dans la lumière.
Avancez l’aiguille de deux à trois millimètres supplémentaires pour vous assurer que l’extrémité du cathéter pénètre dans la veine. Faites glisser le cathéter en plastique sur l’aiguille et dans la veine cave encore cinq millimètres. Retirez l’aiguille lentement et très soigneusement.
Après deux à trois secondes, recherchez des taches blanches se formant dans le foie ou un gonflement de la veine porte, ce qui indique que le tampon de perfusion circule dans le foie et pénètre dans les lobules hépatiques à partir de la veine centrale. Attendez que la veine porte gonfle visiblement dans les une à deux secondes de la formation de taches blanches à la surface du foie. Couper la veine porte avec des ciseaux aussi distalement que possible du hile du foie.
Augmentez le débit à quatre à sept millilitres par minute en fonction du poids de l’animal, de la taille du foie et de l’étendue de l’hépatectomie initiale. Serrez la veine porte avec une pince à épiler ou une pince vasculaire pendant sept à 10 secondes. Assurez-vous qu’aucun liquide ne passe.
Effectuez une deuxième pince après environ 30 secondes et assurez-vous que le foie gonfle et se détend. Continuez à rincer l’animal pendant trois à quatre minutes et observez le tampon clair qui s’écoule de la veine porte. Serrez la veine porte pendant trois à quatre secondes avant que le tampon de digestion n’atteigne le foie.
Assurez-vous que le foie se détend lors de la libération de la pince et que le liquide de perfusion reste clair. Une fois que le tampon de digestion atteint le foie, serrez à nouveau la veine porte. Le foie ne doit pas se détendre après la libération du clampage.
Digérer pendant environ quatre minutes à un débit de cinq millilitres par minute. Au fur et à mesure que la digestion progresse, recherchez des signes de gonflement du foie et de petites sections transparentes à la surface du foie. Observez que le foie prend la texture d’un morceau de tissu humide et semble presque détrempé.
Sondez la consistance en la touchant soigneusement avec un coton-tige humide et stérile. Continuez avec la perfusion jusqu’à ce qu’une différence marquée dans la texture de surface du foie puisse être observée. Observez que le foie prend une couleur très claire et un aspect pétillant indiquant la capsule de Glisson se séparant du parenchyme.
Arrêtez la digestion dès que le foie a acquis ces propriétés. Retirez l’aiguille avant que l’air ne pénètre dans le foie. Saisissez le tissu conjonctif central entre les lobes à l’aide d’une pince et soulevez-le légèrement vers le haut en l’utilisant comme point d’ancrage.
Coupez toutes les connexions du foie à d’autres organes et retirez la vésicule biliaire. Retirez doucement le foie de la cavité abdominale. Soyez prudent car il sera fragile et fragile à ce stade.
Placez le foie dans le tampon de conservation glacé. Transférer le foie dans une boîte de Petri de 10 centimètres et ajouter 10 millilitres de glaçon Williams’Medium E.Rupture de la capsule de Glisson avec une pince à épiler à pointe fine à quelques endroits le long de la surface du foie. Saisissez une partie centrale avec deux paires de pincettes.
Séparez-les lentement, en permettant à la capsule de se déchirer sans endommager les hépatocytes et libérez les cellules en secouant doucement la capsule. Filtrer cinq millilitres de pulpe hépatique à travers une crépine cellulaire de 100 micromètres dans un tube de 50 millilitres. Rincez le filtre avec 10 millilitres de milieu glacé frais et filtrez les cinq millilitres restants de pulpe à travers la crépine cellulaire.
Faire tourner l’extrait à 50 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Aspirez la majeure partie du surnageant, en laissant un millilitre pour remettre les cellules en suspension en faisant tourner doucement le tube. Ajouter 40 millilitres de Williams’E Medium froid et répéter l’étape trois fois.
Procéder à l’isolement des hépatocytes comme décrit dans le manuscrit textuel. Après une hépatectomie de 70% chez la souris, le rendement final des hépatocytes était d’environ 10 à 15 x 10 à la 6ème avec une viabilité finale moyenne de 78%. Alors qu’après une hépatectomie étendue de 86%, le rendement en hépatocytes était de quatre à neuf x 10 à la 6ème avec une viabilité moyenne de 65%.
Après des hépatectomies partielles, les hépatocytes présentent une taille cellulaire accrue par rapport aux foies normaux correspondant à une augmentation de la teneur en lipides. Une augmentation de la teneur en lipides a été observée dans les hépatocytes murins 24 heures après une hépatectomie partielle, considérée comme une augmentation de la granularité ou directement observée par la présence de vésicules lipidiques à l’intérieur des hépatocytes élargis. Lors de l’utilisation de la méthode classique de purification par gradient de densité, de gros hépatocytes gras ont été perdus dans le surnageant et seuls des hépatocytes maigres plus petits sont collectés dans le granulé cellulaire.
Avec le protocole amélioré, les hépatocytes remplis de lipides n’ont pas été perdus et tous les hépatocytes ont été granulés. Le serrage répétitif facilite le processus de rinçage. Avec cela, le foie est éliminé de manière optimale des composants sanguins restants qui pourraient inhiber les enzymes de digestion.
