Cette méthode fournit une technique pour isoler les acides nucléiques de populations de cellules ovariennes spécifiques de la même souris sans avoir besoin de tri cellulaire. Cette technique peut aider à identifier comment des populations cellulaires spécifiques changent dans diverses conditions. Par exemple, avec le vieillissement.
Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une analyse épigénomique et transcriptomique appariée à partir d’un type spécifique de cellules ovariennes sans avoir besoin de tri cellulaire. Cela augmente considérablement le débit, diminue le coût et élimine le besoin d’équipement spécialisé lors de l’analyse spécifique du type cellulaire à partir du tissu ovarien. Ici, notre objectif est d’identifier les changements spécifiques au type cellulaire qui se produisent avec le vieillissement ovarien avant la sénescence reproductive, ce qui a des implications dans le traitement de l’infertilité féminine.
Cette méthode peut être appliquée à n’importe quel type de cellule à travers les systèmes du corps pour lesquels un pilote Cre spécifique au type de cellule est disponible. La partie la plus difficile de cette technique est de choisir une lignée Cre appropriée pour votre type de cellule d’intérêt. Une validation approfondie de la spécificité cellulaire est recommandée.
Pour commencer, prélevez un ovaire de la souris euthanasiée dans 500 microlitres de tampon de lyse nucléique et coupez l’ovaire en huit parties dans le tampon à l’aide de micro-ciseaux à ouverture automatique. Transférer l’ovaire émincé et le tampon de lyse dans un homogénéisateur de rebond en verre sur glace et homogénéiser l’ovaire 10 à 20 fois avec le pilon lâche A.Ajouter 400 microlitres de tampon de lyse au pilon de lavage homogénéisateur de rebond A.Et ensuite homogénéiser l’ovaire avec le pilon serré B 10 à 20 fois. Transférer l’homogénat dans un tube à fond rond de deux millilitres et centrifuger à 200 g pendant 1,5 minute à quatre degrés Celsius pour éliminer les tissus et les vaisseaux sanguins non dissociés.
Après avoir pré-mouillé une crépine cellulaire de 30 micromètres avec 100 microlitres de tampon de lyse, filtrer le surnageant à travers la crépine dans un tube conique de 15 millilitres. Transférer les noyaux contenant le mélange dans un tube à fond rond de deux millilitres. Centrifuger l’échantillon à 500 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et jeter le surnageant.
Remettez en suspension la pastille de noyaux dans 250 microlitres de tampon de lyse glacée en tourbillonnant brièvement à vitesse modérée à élevée. Porter le volume à 1,75 millilitre en ajoutant 1,5 millilitre de tampon de lyse. Mélanger doucement et reposer la suspension de noyaux sur de la glace pendant cinq minutes.
Enduire les noyaux par centrifugation à 500 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Et jetez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille de noyaux. Remettez brièvement en suspension la pastille dans 200 microlitres de tampon de stockage réfrigéré et de vortex pour remettre complètement en suspension la pastille de noyaux.
Réserver 10 % de la pastille remise en suspension comme échantillon de noyaux d’entrée pour l’analyse en aval. Prenez la palette de noyaux en suspension et portez le volume à deux millilitres avec un tampon de purification nucléaire glacé, ou NPB. Ajouter 30 microlitres de billes en suspension pour chaque échantillon dans un tube à fond rond de deux millilitres.
Ajoutez ensuite un millilitre de NPB et remettez bien en suspension par pipetage. Placez le tube sur le rack magnétique pendant une minute pour séparer les perles. Jetez le surnageant et retirez le tube de l’aimant.
Remettez en suspension les billes magnétiques lavées dans un millilitre de NPB. Répétez l’étape de lavage pour un total de trois lavages. Et après le lavage final, remettez les billes en suspension dans le volume initial de NPB.
Ajouter 30 microlitres des billes lavées à deux millilitres de suspension nucléaire et bien remettre en suspension le mélange de noyaux de billes en pipetant et en retournant doucement le tube. Placez les tubes sur un mélangeur rotatif dans une chambre froide ou un réfrigérateur pendant 30 minutes à basse vitesse et incuber les échantillons d’entrée sans billes dans les mêmes conditions. Placez les tubes avec la suspension de noyaux et les perles sur l’aimant pendant trois minutes pour séparer les noyaux biotinylés liés aux billes de streptavidine de la fraction négative des noyaux.
Retirez le surnageant. Passez la fraction négative dans un tube frais de deux millilitres et réservez-la sur de la glace. Pour chaque tube à fraction positive, retirez le tube de l’aimant et remettez en suspension le contenu dans un millilitre de NPB.
Placez le tube sur l’aimant pendant une minute et jetez le surnageant. Remettez en suspension le mélange de noyaux de billes de fraction positive dans 30 microlitres de NPB. Transférer l’ovaire et 100 microlitres de tampon d’homogénéisation dans un homogénéisateur de bounure en verre et homogénéiser 10 à 20 fois avec le pilon lâche A.Ajouter 400 microlitres de tampon d’homogénéisation TRAP au pilon de lavage A et transférer l’homogénat dans un tube à fond rond de deux millilitres.
Lavez l’homogénéisateur avec un millilitre supplémentaire de tampon d’homogénéisation TRAP et transférez le volume lavé dans le tube à fond rond de deux millilitres. Centrifuger l’homogénat à 12 000 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Et transférez le surnageant dégagé dans un nouveau tube à fond rond de deux millilitres.
Après avoir jeté la pastille, transférez 100 microlitres de l’homogénat dégagé dans un nouveau tube à fond rond de deux millilitres et réservez-le comme entrée sur la glace. Incuber le reste de l’homogénat effacé avec cinq microgrammes par millilitre d’anticorps anti-GFP pendant une heure à quatre degrés Celsius tout en tournant dans un mélangeur bout à bout. Incuber l’échantillon d’entrée dans le même état.
Transférer 50 microlitres de billes magnétiques de protéine G pour chaque échantillon dans un tube à fond rond de deux millilitres. Ajouter 500 microlitres de tampon de lavage à faible teneur en sel aux billes et pipeter doucement pour mélanger. Placez le tube dans un support magnétique pendant une minute pour recueillir les perles contre le côté du tube.
Après avoir jeté le surnageant, retirez le tube du support magnétique et ajoutez un millilitre de tampon de lavage à faible teneur en sel dans le tube. Pipeter doucement pour mélanger. Encore une fois, placez le tube dans le support magnétique et répétez l’étape pour un total de trois lavages.
Après le lavage final, remettre les billes en suspension dans le volume initial du tampon de lavage à faible teneur en sel. Transférer les billes lavées en suspension dans le mélange d’anticorps de l’échantillon d’antigène et incuber à quatre degrés Celsius pendant la nuit tout en tournant dans un mélangeur bout à bout. Incuber les échantillons d’entrée pendant une nuit dans des conditions équivalentes.
Après cela, séparez la fraction positive ou les billes magnétiques avec l’ARN des ribosomes cibles de la fraction négative ou du surnageant en utilisant le support magnétique pendant 2,5 à 3 minutes. Aspirer la fraction négative. Placez-le dans un tube à fond rond frais de deux millilitres et mettez-le de côté sur de la glace.
Ajouter 500 microlitres de tampon de lavage à haute teneur en sel dans le tube avec la fraction positive et pipeter doucement pour mélanger. Placez le tube sur un support magnétique maintenu sur de la glace pendant une minute pour séparer les perles. Après avoir jeté le surnageant, retirez le tube de l’aimant et répétez l’étape pour un total de trois lavages.
Après le lavage final, remettre les billes en suspension dans 350 microlitres de tampon de lyse de l’ARN complété par 3,5 microlitres de 2-mercaptoéthanol. Incuber les tubes à température ambiante tout en mélangeant pendant 10 minutes à 900 tr/min dans un agitateur numérique. Séparez les billes de la solution qui contient maintenant l’ARN cible des ribosomes avec un support magnétique pendant une minute à température ambiante.
Recueillir la fraction positive éluée dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. L’imagerie par immunofluorescence a été réalisée sur les ovaires paraffinisés de souris du flox NuTRAP positif au Cyp17-Cre et du flox NuTRAP négatif au Cyp17-Cre. La protéine EGFP a été colorée à l’aide d’anticorps primaires anti-GFP de chèvre et d’anticorps secondaire anti-chèvre Alexa 488 âne, et les noyaux ont été colorés avec DAPI.
Les images ont été prises au microscope à fluorescence à un grossissement de 20x. L’ARN de fraction positive TRAP d’entrée et TRAP a été isolé à partir d’ovaires de souris du flox NuTRAP positif Cyp17-Cre et séquencé de manière terminale. L’analyse en composantes principales de tous les gènes exprimés a montré une séparation de l’entrée TRAP et des fractions positives dans la première composante.
Le tracé volcanique des gènes exprimés différentiellement entre les fractions d’entrée et positives est montré ici. La comparaison de la fraction positive TRAP à l’entrée a montré un enrichissement global des gènes marqueurs des cellules stroma/thèques et l’épuisement des gènes marqueurs des ovocytes de granulosa, immunitaires et musculaires lisses dans la fraction positive TRAP. Après la première centrifugation de la suspension nucléaire pour éliminer les vaisseaux sanguins non dissociés, les noyaux sont dans le surnageant.
Assurez-vous de garder le surnageant et de jeter la pastille à ce stade. En suivant la méthode intacte, plusieurs techniques épigénomiques peuvent être menées, y compris des tests d’accessibilité de la chromatine ou des modifications de l’ADN, entre autres. En suivant la méthode TRAP, un séquençage RT-qCPR ou ARN peut être effectué pour évaluer le translatome.
Il s’agit de la première application de la méthode NuTRAP dans l’ovaire de souris. Cela permet une analyse épigénomique et transcriptomique à haut débit à partir de types de cellules ovariennes spécifiques, qui peuvent être utilisées pour étudier le vieillissement ovarien ou le cancer.
