L’Office of Science and Engineering Laboratories de la FDA développe des outils scientifiques réglementaires pour aider les développeurs de dispositifs médicaux et les examinateurs de la FDA. Notre objectif ultime est d’accélérer l’accès des patients à des dispositifs médicaux innovants, sûrs et efficaces grâce aux meilleures données scientifiques disponibles. Dans ce protocole, nous appliquons une technologie de pointe des cellules souches pluripotentes induites à l’évaluation des dispositifs médicaux utilisés pour traiter des maladies cardiaques potentiellement mortelles.
Cet outil simple permet une évaluation reproductible des appareils d’électrophysiologie cardiaque dans la boîte à l’aide d’un équipement de laboratoire standard. Il peut également être utilisé avec des cellules spécifiques au patient dérivées de donneurs atteints de diverses maladies cardiaques. Pour commencer, plaquez les cardiomyocytes humains décongelés dérivés de l’iPSC sur des plaques stériles à six puits recouvertes de gélatine à 0,1% au moins deux jours avant l’ensemencement des cardiomyocytes sur le substrat d’hydrogel flexible.
Culture des cardiomyocytes humains dérivés de l’iPSC dans un milieu cardiomyocytaire standard pendant deux à quatre jours à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pour leur permettre de récupérer de la cryoconservation. Rafraîchir le milieu usé avec un milieu 100% cardiomyocytaire toutes les 48 heures. Vérifier l’état des cardiomyocytes humains dérivés de l’iPSC avant la dissociation en évaluant la santé des cellules, en assurant la viabilité et un battement stable.
Lavez les cardiomyocytes avec quatre millilitres par puits de DPBS sans chlorure de calcium ni chlorure de magnésium. Ajouter un millilitre de réactif de dissociation à température ambiante à chaque puits et incuber pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 10 millilitres de milieu cardiomyocytaire dans un tube conique stérile de 15 millilitres.
Dissocier les cardiomyocytes des plaques à six puits avec une pipette de 1 000 microlitres et ajouter la suspension cellulaire au tube conique. Rincez les puits avec un millilitre de milieu cardiomyocytaire frais pour recueillir les cardiomyocytes résiduels et les ajouter au tube conique. Amenez ensuite le volume final du tube conique à 15 millilitres avec le milieu.
Centrifuger le tube à 200 G pendant cinq minutes et retirer le surnageant jusqu’à la marque d’un millilitre. Remettez en suspension les cellules dans le milieu cardiomyocytaire jusqu’à un volume final de cinq millilitres et comptez les cardiomyocytes avec un compteur de cellules manuel ou automatisé. Ensuite, incuber la suspension cellulaire cardiomyocytaire pendant environ 30 minutes à température ambiante pendant que les substrats d’hydrogel flexibles sont préparés.
Préparez une pipette de 20 microlitres réglée à un microlitre, des pointes de pipettes, une plaque inférieure en verre stérile de 48 puits et une minuterie de chronomètre dans la hotte de culture tissulaire. Mélangez la matrice extracellulaire ou le substrat d’hydrogel à base d’ECM en tapotant doucement le tube et en le replaçant immédiatement sur la glace. Démarrez la minuterie du chronomètre immédiatement avant de plaquer le premier substrat d’hydrogel et marquez-la comme temps zéro.
Pipeter un microlitre du substrat d’hydrogel de haut en bas environ trois fois pour refroidir l’extrémité de la pipette. Appliquez ensuite environ un microlitre du substrat d’hydrogel non dilué horizontalement au fond de chaque puits dans la plaque de 48 puits, en tenant la pipette à un angle de 45 degrés. Plaquez tous les substrats d’hydrogel dans la même orientation dans chaque puits pour aider à identifier le substrat lors de l’exécution des expériences à un grossissement de 40X.
Placez le couvercle sur la plaque de 48 puits et laissez les substrats d’hydrogel incuber pendant huit à 10 minutes à température ambiante dans la hotte de culture tissulaire avant d’ajouter les cellules. Après l’incubation, ensemencer immédiatement les cardiomyocytes goutte à goutte directement sur les substrats d’hydrogel avec environ 30 000 cardiomyocytes viables par puits dans un faible volume moyen d’environ 200 microlitres de milieu cardiomyocytes. Après avoir fermé le couvercle, laissez les cardiomyocytes incuber sans être dérangés pendant 10 à 15 minutes à température ambiante dans la hotte pour permettre aux cellules d’adhérer au substrat d’hydrogel.
Ajouter doucement 100 microlitres de milieu cardiomyocytaire frais à chaque puits. Placez la plaque fermée du couvercle sur un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant deux à quatre jours. Allumez le microscope et la chambre de contrôle de l’environnement pour équilibrer à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Retirer le milieu cardiomyocytaire de la plaque à 48 puits et rincer doucement chaque puits deux fois avec 600 microlitres de milieu de dosage de la contractilité cardiaque ou CCM. Ajoutez ensuite 300 microlitres de milieu d’essai CCM par puits et placez la plaque de 48 puits au microscope dans la chambre de contrôle de l’environnement. Insérez les électrodes et équilibrez les cellules pendant cinq minutes.
Pour enregistrer les vidéos de contraction à l’aide de la microscopie vidéo, ouvrez le logiciel d’enregistrement vidéo et définissez une fréquence d’images de 100 images par seconde. Sélectionnez ensuite une région d’intérêt ou un retour sur investissement près du centre de la monocouche hiPSC-CM. Ensuite, le champ stimule les cellules avec un générateur d’impulsions commercial pour rythmer électriquement les monocouches de cardiomyocytes 2D.
Placez le cardiomyocyte à 1,5 fois le seuil à un hertz avec des paramètres de pouls de base. Par exemple, des impulsions de stimulation monophasiques à ondes carrées avec une durée d’impulsion de stimulus de deux millisecondes de cinq volts. Enregistrez la vidéo de contraction de la ligne de base avant le CCM pendant au moins cinq temps.
Stimulez ensuite la monocouche de cardiomyocytes avec un signal électrique expérimental de retard de 30 millisecondes, deux impulsions biphasiques symétriques d’une durée de phase de 5,14 millisecondes, avec une durée totale de 20,56 millisecondes, une amplitude de phase de 10 volts et un intervalle d’interphase nul. Enregistrez la vidéo de contraction induite par CCM pendant au moins cinq temps. Éteignez le signal CCM, stimulez avec une impulsion de stimulation de base et enregistrez une vidéo de contraction de la période de récupération après le CCM pendant au moins cinq temps.
Utilisez un logiciel de contraction standard pour analyser automatiquement les vidéos de contraction et quantifier les propriétés contractiles clés telles que l’amplitude de contraction, la pente de contraction, la pente de relaxation, le temps jusqu’au pic, le temps jusqu’à la ligne de base 90% et la durée de contraction 50%Les propriétés contractuelles monocouches des cardiomyocytes humains dérivés de l’iPSC humain 2D ont été caractérisées et les paramètres clés de la contractilité des cardiomyocytes ont été quantifiés. L’application des paramètres de stimulation standard de la CCM a permis d’améliorer les propriétés contractiles in vitro. Les effets de la modulation extracellulaire des concentrations de calcium sur les propriétés contractiles humaines avec et sans stimulation CCM ont été évalués.
La dépendance au calcium attendue à l’inclusion de la contraction a été observée, ainsi qu’une augmentation de la sensibilité au calcium induite par CCM au niveau de la monocouche cardiomyocytes. En outre, l’interrogation pharmacologique de la voie de signalisation bêta androgénique a révélé que les effets inotropes induits par la CCM étaient en partie médiés par la signalisation bêta-adrénergique. De plus, cet outil peut être étendu aux cardiomyocytes pathologiques spécifiques au patient, y compris ceux de la cardiomyopathie dilatée afin de comprendre l’effet de la CCM dans le contexte des états pathologiques.
Ici, nous nous concentrons principalement sur l’évaluation des propriétés contractiles humaines. Cependant, en utilisant cet outil, on pourrait également évaluer d’autres lectures de couplage de contraction d’excitation cardiaque, y compris les potentiels d’action et la manipulation du calcium. Il s’agit du premier outil scientifique réglementaire à combiner les cellules souches pluripotentes induites par la technologie avec l’évaluation des dispositifs cardiaques.
Cette méthode alternative ouvre la voie à l’évaluation des dispositifs médicaux dans une boîte et a le potentiel de réduire le besoin de tests sur des sujets animaux et humains.
