La distribution diffuse et la portée visuelle limitée du TEM présentent des défis pour l’analyse de l’infrastructure. Ce protocole présente une méthode innovante et efficace de préparation d’échantillons qui surpasse l’approche conventionnelle. Cette méthode avancée de préparation des échantillons TEM est plus efficace pour empêcher l’enroulement des échantillons par rapport à la méthode traditionnelle en permettant aux échantillons de rester plats pendant la déshydratation ultérieure.
La sélection des réactifs et l’ajustement de la posologie doivent être nécessaires en fonction du type d’échantillon. De nombreux réactifs chimiques toxiques sont utilisés dans le processus de préparation des échantillons. La démonstration de la procédure sera assurée par Sheng Qingyuan, un étudiant en master du laboratoire du Dr Gan Guangming.
Pour commencer, disséquez les larves de drosophile errantes de la fin du troisième stade dans la solution de janvier et obtenez toute la paroi du corps selon les procédures standard. Fixez la paroi du corps larvaire avec le fixateur dans la chambre de dissection pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, transférez la paroi du corps larvaire de la chambre de dissection dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre et rincez-la plusieurs fois avec un tampon de cacodylate de sodium.
Fixez la paroi du corps larvaire avec du tétroxyde d’osmium à 1 % pendant deux heures. Après la fixation, laver les échantillons plusieurs fois avec de l’eau distillée. Ajoutez une solution d’acétate d’urinoir saturée à 2 % dans le tube pour colorer la jonction neuromusculaire PHI.
Et après deux heures, rincez les échantillons à l’eau déminéralisée. Ensuite, à l’aide de ciseaux, coupez deux morceaux ronds de treillis métallique de taille de pore de 270 microns. Placez le treillis métallique à la base d’une bouteille à fond plat.
Placez ensuite les larves fixes sur le grillage, puis placez un autre treillis. Déshydratez les échantillons à une concentration croissante d’éthanol pendant 20 minutes chacun à quatre degrés Celsius. Ensuite, rincez deux fois les échantillons avec de l’oxyde de propylène à température ambiante pendant cinq minutes chacun.
Ensuite, placez les échantillons dans une solution d’oxyde de propylène et de résine époxy, suivie de résine époxy pure pendant deux heures à température ambiante. Pour l’enrobage, découpez un film de polyéthylène en un grand carré et un petit support rectangulaire creux. Collez le petit carré avec le grand carré.
Ajoutez suffisamment de résine époxy au centre du grand carré. Allumez ensuite le stéréoscope et placez les échantillons dans la résine époxy prépositionnée avec le côté musculaire vers le haut. Ajoutez plusieurs gouttes de résine époxy sur les échantillons et recouvrez-les d’un film de polyéthylène.
Placez les échantillons pour la polymérisation à des températures croissantes pendant 24 heures chacun. Après polymérisation, à l’aide d’une lame tranchante, retirez les parties en excès du corps larvaire tout en conservant un trapèze, y compris les segments A2 et A3. Retirez le trapèze de la paroi restante du corps larvaire et fixez-le à la capsule remplie de résine avec de la colle AB.
Au microscope optique, confirmez la position des sixième et septième muscles des segments A2 et A3, en maintenant le plan tangent parallèle au sixième muscle. Ensuite, coupez un cinquième de l’échantillon le long des deux côtés du segment A3. À l’aide d’un microtome, préparez une section ultra fine de l’échantillon en partant du sixième muscle.
Après la section, fixez autant de tranches que possible à chaque maille de cuivre. Utilisez un microscope électronique à transmission pour observer les échantillons. Parmi la résine Lowicryl K4M et la résine époxy, la résine Lowicryl K4M a fourni des résultats plus nets et plus facilement observables des muscles du corps de la drosophile.
L’imagerie confocale a démontré une meilleure visualisation de la jonction neuromusculaire entre les sixième et septième muscles. La microscopie électronique à transmission a révélé des jonctions neuromusculaires ressemblant à des billes, offrant des informations améliorées sur la structure synaptique. Les échantillons sont restés plats tout au long du processus de déshydratation en raison de la restriction des mailles métalliques.
De plus, les échantillons ont été polymérisés entre les produits en plastique, empêchant les échantillons de se plier. À l’avenir, la méthode de préparation d’échantillons TEM pourra être appliquée au neuropil du cerveau et du cordon nerveux ventral, améliorant ainsi le potentiel de la recherche ultrastructurale.
