La distribución difusa y el alcance visual limitado del TEM presentan desafíos para el análisis de infraestructura. Este protocolo presenta un método innovador y eficiente de preparación de muestras que supera el enfoque convencional. Este método avanzado de preparación de muestras TEM es más eficaz para evitar el curvamiento de las muestras en comparación con el método tradicional, ya que permite que las muestras permanezcan planas durante la deshidratación posterior.
La selección de reactivos y el ajuste de la dosis deben ser necesarios en función del tipo de muestra. Hay muchos reactivos químicos tóxicos utilizados en el proceso de preparación de muestras. La demostración del procedimiento estará a cargo de Sheng Qingyuan, un estudiante de maestría del laboratorio del Dr. Gan Guangming.
Para comenzar, diseccione las larvas de Drosophila del tercer estadio tardío errantes en solución de Jan y obtenga toda la pared del cuerpo según los procedimientos estándar. Fije la pared del cuerpo de la larva con el fijador en la cámara de disección durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, transfiera la pared del cuerpo de la larva de la cámara de disección a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros y enjuáguelo varias veces con tampón de cacodilato de sodio.
Fije la pared del cuerpo de la larva en tetróxido de osmio al 1% durante dos horas. Después de la fijación, lavar las muestras varias veces con agua destilada. Agregue una solución de acetato urinario saturado al 2% en el tubo para teñir la unión neuromuscular PHI.
Y después de dos horas, enjuague las muestras con agua desionizada. A continuación, con unas tijeras, corte dos piezas redondas de malla metálica de un tamaño de poro de 270 micras. Coloca la malla metálica en la base de una botella de fondo plano.
Luego coloque las larvas fijadas en la malla, seguido de la colocación de otra malla. Deshidratar las muestras en una concentración creciente de etanol durante 20 minutos cada una a cuatro grados centígrados. A continuación, enjuague las muestras dos veces con óxido de propileno a temperatura ambiente durante cinco minutos cada una.
A continuación, coloque las muestras en una solución de óxido de propileno y resina epoxi, seguida de resina epoxi pura durante dos horas a temperatura ambiente. Para incrustar, corte una película de polietileno en un cuadrado grande y un soporte rectangular pequeño y hueco. Pega el cuadrado pequeño con el cuadrado grande.
Agrega suficiente resina epoxi en el centro del cuadrado grande. A continuación, encienda el estereoscopio y coloque las muestras en la resina epoxi precolocada con el lado del músculo hacia arriba. Agregue varias gotas de resina epoxi sobre las muestras y cúbralas con una película de polietileno.
Coloque las muestras para la polimerización a temperaturas crecientes durante 24 horas cada una. Después de la polimerización, con una cuchilla afilada, retire las partes sobrantes del cuerpo larvario mientras conserva un trapecio, incluidos los segmentos A2 y A3. Retire el trapecio de la pared del cuerpo larvario restante y fíjelo a la cápsula llena de resina con pegamento AB.
Bajo un microscopio óptico, confirme la posición de los músculos sexto y séptimo de los segmentos A2 y A3, manteniendo el plano tangente paralelo al sexto músculo. A continuación, corte una quinta parte de la muestra a lo largo de los dos lados del segmento A3. Con un micrótomo, prepare una sección ultrafina de la muestra a partir del sexto músculo.
Después de seccionar, fije tantas rodajas como sea posible a cada malla de cobre. Utilice un microscopio electrónico de transmisión para observar las muestras. Entre la resina Lowicryl K4M y la resina epoxi, la resina Lowicryl K4M proporcionó resultados más nítidos y fácilmente observables de los músculos corporales de Drosophila.
Las imágenes confocales demostraron una mejor visualización de la unión neuromuscular entre el sexto y el séptimo músculo. La microscopía electrónica de transmisión reveló uniones neuromusculares en forma de perlas, lo que ofrece una mejor información sobre la estructura sináptica. Las muestras permanecieron planas durante todo el proceso de deshidratación debido a la restricción de las mallas metálicas.
Además, las muestras se polimerizaron entre los productos plásticos, evitando que las muestras se doblaran. En el futuro, el método de preparación de muestras TEM se puede aplicar al neuropilo del cerebro y del cordón nervioso ventral, mejorando así el potencial de la investigación ultraestructural.
