يمثل التوزيع المنتشر والنطاق البصري المحدود ل TEM تحديات لتحليل البنية التحتية. يقدم هذا البروتوكول طريقة مبتكرة وفعالة لإعداد العينات تتجاوز النهج التقليدي. هذه الطريقة المتقدمة لإعداد عينة TEM أكثر فعالية في منع تجعد العينات مقارنة بالطريقة التقليدية من خلال السماح للعينات بالبقاء مسطحة أثناء الجفاف اللاحق.
يجب أن يكون اختيار الكواشف وتعديل الجرعة ضروريا اعتمادا على نوع العينة. هناك العديد من الكواشف الكيميائية السامة المستخدمة في عملية تحضير العينة. وسيظهر الإجراء شنغ تشينغيوان ، طالب ماجستير من مختبر الدكتور غان غوانغمينغ.
للبدء ، قم بتشريح يرقات ذبابة الفاكهة الثالثة المتجولة في محلول يناير ، واحصل على جدار الجسم بالكامل وفقا للإجراءات القياسية. ثبت جدار جسم اليرقات بالمثبت في غرفة التشريح طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، قم بنقل جدار جسم اليرقات من غرفة التشريح إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 ملليلتر ، وشطفه عدة مرات باستخدام محلول كاكوديلات الصوديوم.
إصلاح جدار الجسم اليرقات في 1 ٪ رابع أكسيد الأوزميوم لمدة ساعتين. بعد التثبيت ، اغسل العينات عدة مرات بالماء المقطر. أضف 2٪ محلول أسيتات مبولة مشبع في الأنبوب لتلطيخ الوصلة العصبية العضلية PHI.
وبعد ساعتين ، شطف العينات بالماء منزوع الأيونات. بعد ذلك باستخدام المقص ، قم بقطع قطعتين مستديرتين من شبكة معدنية بحجم المسام 270 ميكرون. ضع الشبكة المعدنية في قاعدة زجاجة مسطحة القاع.
ثم ضع اليرقات الثابتة على الشبكة ، متبوعة بوضع شبكة أخرى. جفف العينات بتركيز متزايد من الإيثانول لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات سلزية. ثم شطف العينات مرتين مع أكسيد البروبيلين في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق لكل منهما.
بعد ذلك ، ضع العينات في محلول أكسيد البروبيلين وراتنجات الايبوكسي ، متبوعا براتنجات الايبوكسي النقية لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. للتضمين ، قم بقطع فيلم البولي إيثيلين إلى مربع كبير ودعم مستطيل صغير مجوف. الغراء مربع صغير مع مربع كبير.
أضف راتنجات الايبوكسي الكافية في وسط المربع الكبير. ثم قم بتشغيل المجسمة ، وضع العينات في راتنجات الايبوكسي الموضوعة مسبقا مع توجيه جانب العضلات لأعلى. أضف عدة قطرات من راتنجات الايبوكسي على العينات ، وقم بتغطيتها بفيلم البولي إيثيلين.
ضع عينات البلمرة في درجات حرارة متزايدة لمدة 24 ساعة لكل منها. بعد البلمرة ، باستخدام شفرة حادة ، قم بإزالة الأجزاء الزائدة من جسم اليرقات مع الاحتفاظ بشبه منحرف ، بما في ذلك الجزء A2 و A3. قم بإزالة شبه المنحرف من جدار جسم اليرقات المتبقي ، وقم بإرفاقه بالكبسولة المملوءة بالراتنج باستخدام غراء AB.
تحت المجهر الضوئي ، تأكد من موضع العضلات السادسة والسابعة من الجزأين A2 و A3 ، مع الحفاظ على مستوى الظل الموازي للعضلة السادسة. ثم اقطع خمس العينة على طول جانبي الجزء A3. باستخدام ميكروتوم ، قم بإعداد قسم رفيع جدا من العينة بدءا من العضلة السادسة.
بعد التقسيم ، قم بتوصيل أكبر عدد ممكن من الشرائح بكل شبكة نحاسية. استخدم المجهر الإلكتروني النافذ لمراقبة العينات. من بين راتنج Lowicryl K4M وراتنجات الايبوكسي ، قدم راتنج Lowicryl K4M نتائج أكثر حدة ويمكن ملاحظتها بسهولة أكبر لعضلات جسم ذبابة الفاكهة.
أظهر التصوير البؤري تصورا محسنا للوصلة العصبية العضلية بين العضلات السادسة والسابعة. كشف المجهر الإلكتروني النافذ عن تقاطعات عصبية عضلية تشبه الخرز ، مما يوفر معلومات بنية متشابكة محسنة. ظلت العينات مسطحة طوال عملية الجفاف بسبب تقييد الشبكات المعدنية.
إلى جانب ذلك ، تم بلمرة العينات بين المنتجات البلاستيكية ، مما منع العينات من الطي. في المستقبل ، يمكن تطبيق طريقة تحضير عينة TEM على الدماغ والحبل العصبي البطني ، وبالتالي تحسين إمكانات أبحاث البنية الفائقة.
