Cette technique permet d’identifier efficacement le génotype S et d’identifier avec précision l’auto-incompatibilité des agrumes, fournissant les informations nécessaires à la sélection d’arbres pollinisateurs appropriés. Il s’agit d’une technique rapide, simple et fiable pour sélectionner les arbres parents appropriés dans les programmes de sélection. Cette technique est simple et facile à faire et faire l’expérience pour la première fois nécessite de la patience et du soin.
L’identification du génotype S et la conception de l’amorce spécifique S nécessitent plus d’attention et de soin. Yu Hu, un étudiant diplômé en master de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Commencez la collecte de pollen en apportant les fleurs de Majia pomelo, Citrus maxima, au laboratoire.
Recueillir les anthères à l’aide d’une pince à épiler et les placer dans une boîte de Petri contenant du papier filtre. Sécher les grains de pollen en plaçant la boîte de Petri contenant les anthères dans un four à 28 degrés Celsius pendant 24 heures. Après séchage, conservez le pollen dans un sac à fermeture à glissière hermétique Micro Centron contenant du gel de silice à changement de couleur.
Fermez le sac et étiquetez-le avec le nom de la variété de pollen et la date de stockage. Versez 300 microlitres de milieu liquide dans le bouchon d’un tube centrifuge de deux millilitres et saupoudrez le pollen uniformément à l’aide d’une brosse de pollinisation. Placez le pollen dans une boîte noire humidifiée et incuber à 28 degrés Celsius pendant 12 heures.
Après l’incubation, coupez l’embout supérieur d’un millimètre d’une pointe de pipette de 1 000 microlitres et aspirez le pollen avec une petite quantité de solution de culture. Placez le pollen au centre de la lame de microscope et recouvrez-le d’un couvercle. Une fois cela fait, observez l’échantillon avec un microscope inversé à l’aide d’un objectif 10X.
Effectuer trois répétitions indépendantes en utilisant approximativement la même densité pollinique pour chaque réplication. Pour la pollinisation, utilisez un pinceau de pollinisation pour répandre une quantité suffisante de pollen viable sur la surface du stigmate, en veillant à ne pas endommager le pistil. Couvrir les fleurs pollinisées avec un sac en papier sulfate et empêcher la pollinisation par des pollens génotypiquement distincts en scellant le sac à l’aide d’un trombone.
Inscrivez le nom de l’espèce ainsi que le nombre et l’heure de la pollinisation sur l’étiquette. Accrochez l’étiquette sur les branches près des fleurs pollinisées. Retirez les sacs de pollinisation environ trois à quatre jours après la pollinisation et recueillez les fleurs pollinisées dans des sacs à fermeture à glissière.
Retirez immédiatement les pétales, les récipients et les ovaires des fleurs et plongez le stigmate fusionné pour le coiffer dans un tube centrifuge contenant une solution fixatrice fraîchement préparée. Incuber le stigmate et le style dans la solution fixatrice pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, jetez la solution fixatrice avant de laver le stigmate et de coiffer deux à trois fois dans de l’éthanol à 95%.
Ensuite, ajoutez une solution à 70% d’éthanol au style, en vous assurant que l’échantillon est complètement immergé dans la solution. Les styles à ce stade peuvent être stockés à quatre degrés Celsius pendant un à deux mois. Pour la coloration au bleu d’aniline, laver les échantillons de style stockés dans de l’éthanol à 70% avec de l’eau distillée trois à quatre fois.
Immergez-le dans une solution d’hydroxyde de sodium à quatre molaires et scellez-le avant de l’incuber dans un bain-marie à 65 degrés Celsius pendant 60 minutes. Au cours de cette étape, la couleur du style passe du jaune-blanc au rouge orangé. Ensuite, faites tremper les styles dans de l’eau distillée.
Après 30 minutes, jetez l’eau distillée et lavez les styles avec de l’eau distillée trois à quatre fois ou jusqu’à ce que la couleur du style devienne jaune. Ensuite, ajoutez le bleu d’aniline jusqu’à ce que l’échantillon soit immergé et incuber pendant 12 heures dans l’obscurité. Observez la croissance du tube pollinique au microscope à fluorescence.
Placez la diapositive sur une table plate. Divisez le style en deux moitiés le long de l’axe longitudinal à l’aide d’un scalpel. Placez la moitié du style sur une lame de verre et ajoutez deux à trois gouttes de polyéthylène glycol à la surface de la lame.
Ensuite, couvrez-le d’un bordereau de couverture. Une fois cela fait, placez la lame sur la platine du microscope au-dessus de l’ouverture et visualisez à l’aide d’un objectif 10X. Utilisez le filtre DAPI et observez la croissance du tube pollinique.
Observez cinq styles pour chaque type de pollinisation. La viabilité pollinique des Citrus maxima et les taux de germination ont été quantifiés par microscopie fluorescente. Le pollen compatible a germé avec succès à la surface du stigmate et a produit un tube pollinique normal, qui s’est développé et a finalement conduit à la fécondation dans l’ovaire.
En revanche, des tubes polliniques incompatibles se sont développés à travers environ 2/3 du style, puis ont cessé de croître. L’électrophorèse sur gel d’agarose a détecté le produit d’ADN amplifié à l’aide des amorces spécifiques du locus S. Il a montré l’amplification du produit ADN entre 500 et 1 000 paires de bases.
Le génotype S correspondant a été identifié. 21 haplotypes S chez différentes espèces d’agrumes ont été identifiés à l’aide de cette méthode. L’étape de pollinisation est critique.
Seule une pollinisation réussie peut assurer l’observation ultérieure des tubes polliniques. La technique a été utilisée pour analyser les traits d’auto-incompatibilité et pour explorer et identifier les déterminants féminins de l’auto-incompatibilité. Cette méthode est importante pour la recherche sur l’auto-incompatibilité et les programmes de sélection.
Il peut également aider la communauté agricole à sélectionner des arbres pollinisateurs pour leurs vergers.
