Nous remercions Sankalpi Warnasooriya et Amy Humboldt pour la lecture critique et l&#39;édition du manuscrit. Ce travail a été soutenu par des subventions du ministère de l&#39;Énergie (DE-SC0008769) et la National Science Foundation (IOS-1127017).

Une. Croissance de S. viridis <ol><li> Définissez les conditions de la chambre de croissance à 31 ° C/22 ° C (jour / nuit), 12 h lumière/12 h sombre, l&#39;humidité relative de 50% avec un traitement avant l&#39;aube du 15 ° C 8 heures et demie-09h00 AM. (Figure 1). Dans ces conditions, S. viridis A10.1 prend environ 21-22 jours à partir de semis à la floraison. </li><li> Remplissez appartements (4 x 9 cellules) avec Metro Mix 360 et enlever une cellule pour l&#39;arrosage. </li><li> Eau légère brume sur la surface du sol. </li><li> Semer des graines à la surface du sol, une graine par cellule. </li><li> Recouvrez les graines d&#39;une couche de sol (environ 0,5 cm) </li><li> Mist la surface de sol et d&#39;eau appartements à partir du bas. Gardez l&#39;arrosage du fond après semis. </li><li> Pour chaque croix qui sera effectuée au moins trois usines sera utilisé comme parents femelles et neuf usines sera utilisé en tant que parents de sexe masculin. Semences semis doit être échelonnée comme toutes les plantes ne fleurissent le même jour. Graine sowing est recommandé chaque jour sur une période de trois jours. </li><li> Arroser les plantes en 1-2 fois par jour, ce qui dépend de la taille des plantes et de l&#39;état du sol. L&#39;excès d&#39;eau dans le sol n&#39;est pas favorable à la croissance optimale des plantes, et peut conduire à la croissance des champignons dans le sol et les dommages des tissus foliaires. </li><li> Fertiliser les plantes deux fois par semaine, à l&#39;aide de Jack 15-16-17 à une concentration de 100 ppm. </li></ol> 2. Découper et d&#39;étiquetage des panicules Avant émasculation - Jour 1 <ol><li> Dans l&#39;après-midi ou le soir avant la pollinisation, déplacer des plantes de la chambre de croissance au laboratoire (température (T): 24,06 ° C ± 0,13 ° C, l&#39;humidité relative (HR) 21,79% ± 1,15%). </li><li> Sélectionnez les panicules primaires ayant une fleur à 1/3 de fleurs sur la panicule qui ont déjà fleuri. </li><li> Dans cette étude, les quatre domaines au sein de la panicule sont définis comme suit (Figure 2A; pointe, milieu distale, moyenne et base proximale). </li><li> Idéalement, choiea panicule avec 1-5 fleurs qui ont fleuri, couper le sommet de la panicule (extrémité distale), et supprimer toutes les fleurs dans les sections intermédiaire et base de proximité à l&#39;aide de ciseaux à ressort ou une pince fine. </li><li> Si une panicule a environ dixième-cinquième de fleurs qui ont fleuri, coupez le bout et couper des fleurs de la base de la panicule, ne conserver que la partie inférieure du milieu distale et la partie supérieure du milieu proximal pour tailler davantage. </li><li> Si une panicule a environ un quart-1/2 de fleurs qui ont fleuri, coupez la partie centrale distale et ne conserver que la section du milieu proximal pour plus de garniture. </li><li> Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour couper légèrement les poils. </li><li> Retirez toutes les fleurs qui ont fleuri et toutes les fleurs immatures laissant environ 20-30 fleurs / panicule qui sont distribués uniformément dans la région (figure 3). Pratique des soins de conserver les poils de la région qui seront pollinisées afin de protéger les fleurons de possibles dommages de la chaleur.Pour chaque épillet, conserver le fleuron le plus mature supérieure. La plupart fleuron supérieurs auront une probabilité plus élevée de la floraison au moment de la pollinisation (figure 2B). </li><li> Marquer un côté de chaque fleur avec un marqueur permanent rouge et enregistrer le nombre de fleurons de la panicule (figure 2B). </li><li> Drapeau de la panicule avec les informations suivantes: la date de l&#39;émasculation, la durée et la température à laquelle la castration est effectuée. </li><li> Une fois la panicule est coupé, retirez tous les talles de chaque plante pour assurer la redistribution de plus de ressources pour le développement de la panicule principale. </li></ol> 3. Émasculation avec Eau Chaude-trempage - Jour 1 <ol><li> Régler le bain d&#39;eau à 48 ° C ± 0,1 ° C pendant le traitement thermique. </li><li> Pliez doucement les panicules garnis et les tremper dans l&#39;eau chaude à 48 ° C pendant 3-6 min. Faites attention à ne pas casser la tige de la panicule. </li><li> Environ 3-4 panicules peuvent être trempés together à une heure, tout en maintenant un espace suffisant entre les panicules à une distribution uniforme de la chaleur. Il est essentiel de submerger toute la panicule dans l&#39;eau chaude pendant le traitement thermique. La dernière feuille (la feuille sous-tendant la panicule qui fournit les éléments nutritifs à la panicule) ne doit pas entrer en contact avec de l&#39;eau chaude pour éviter les dommages de la chaleur dans les tissus de la feuille. </li><li> Une fois la castration est effectuée pour la durée souhaitée, retirez panicules du bain d&#39;eau et secouez doucement hors de l&#39;eau à partir de la panicule. </li><li> Placez un sac de pain micro-perforé sur mesure pour couvrir entièrement la panicule émasculé et le fixer avec une ligature. Sacs à pain Micro-perforées peuvent être personnalisés en fonction de la taille de la panicule (notamment dans la vidéo). </li><li> Placez les plantes de retour dans la chambre de croissance jusqu&#39;au lendemain. </li></ol> 4. Crossing / pollinisation après émasculation - Jour 2 et Jour 3 <ol><li> A 09h00 le jour 2 et jour 3, déplacer femelle (émasculé) et male parents de la chambre de croissance au laboratoire (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, humidité relative: 21,79% ± 1,15%) à réaliser des croisements. </li><li> Observer et ajouter un autre point rouge à fleurs qui ont fleuri ou sont en fleurs à l&#39;aide d&#39;un marqueur permanent rouge. Inscrivez le nombre total de fleurs épanouies par panicule. </li><li> Notez la date de la pollinisation et le nom du parent mâle sur le tag pour garder une trace de ce que les croisements sont effectués. </li><li> Respecter le temps de pic de la floraison chez les parents de sexe masculin. Dans nos conditions de chambre (figure 1) des fleurs sur les panicules du parent mâle commencent ouverture synchrone autour de 10:10. À partir du moment de l&#39;ouverture des fleurs, le exsertion complète des anthères et la libération du pollen se fera après 20 min. </li><li> L&#39;étape idéale pour la pollinisation est l&#39;étape au cours de laquelle le pollen du parent mâle est libéré. Les fleurs se ferment après 20 min de la libération du pollen. Par conséquent, la durée de la floraison est d&#39;environ 40 min à partir du moment de l&#39;ouverture de l&#39;écoulementteurs. La couleur du pollen passe du blanc jaunâtre au brun sur une période d&#39;environ 30 minutes après que la fleur se referme. </li><li> Commencez dès que la pollinisation anthères blanc jaunâtre sont visibles sur les fleurs de parent mâle. Pollinisations sont effectuées sur les jours 2 et 3 en utilisant l&#39;une des trois techniques: <ol><li> Panicule à panicule pollinisation: en utilisant un panicule détaché que le mâle, frottez doucement la panicule avec la panicule émasculé pour faciliter la pollinisation et jetez la panicule mâle pour éviter la contamination. Répétez le processus de pollinisation jusqu&#39;à ce que chaque panicule émasculé a été pollinisées par 2-3 panicules. </li><li> Anthères à la stigmatisation pollinisation: en utilisant une pince ramasser une fleur qui s&#39;épanouit avec anthères blanc jaunâtre ou choisir anthères et physiquement en contact avec le stigmate de la fleur sur le parent femelle. Utilisez une fleur du parent mâle pour polliniser une fleur sur la panicule émasculé. Répétez la pollinisation process jusqu&#39;à ce que chaque stigmate sur la panicule émasculé a été pollinisées par les quelques (2-3) fleurs / anthères. Le port d&#39;une visière grossissant rendra une meilleure visibilité pour effectuer la pollinisation. </li><li> Entre les pollinisations de différents parents mâles, plonger la pince à 95% d&#39;éthanol puis en les essuyant avec Kimwipes pour éviter la contamination en raison de reports de pollen entre les différents croisements. </li><li> Liaison panicule: Après la castration, sélectionnez 3-4 panicules sur le parent mâle qui fleuriront le lendemain. Liez-les avec la panicule émasculé du parent femelle utilisant une ligature. Placez la panicule émasculé légèrement en dessous de la panicule du parent mâle. Placez un sac de cristal sur les panicules et fixer le sac à la base avec un trombone. Ceci peut être réalisé le jour 2 fois les panicules du parent mâle commencent la floraison. </li><li> Au cours de la période de floraison dans la matinée du jour 2 et jour 3, film ou secouer le sac de cristal pour facipollinisation liter. Continuer à feuilleter ou secouer panicules toutes les 15 minutes pendant toute la durée de la floraison dans la matinée (entre 09h00-11: 00 heures). Retirer panicules de parent mâle après la pollinisation et étiqueter le côté opposé des fleurs épanouies sur la panicule émasculé. Notez le nombre de fleurs épanouies sur la panicule de chaque parent femelle. </li></ol></li><li> Une fois la pollinisation a été effectuée, placer un sac de pain micro-perforé sur mesure pour couvrir la panicule du parent femelle et garantir à la base en utilisant une ligature après la pollinisation jusqu&#39;à la récolte de graines. </li></ol> 5. Semences de récolte <ol><li> graines de la récolte au bout de 2 semaines (14-16 jours) à compter du jour de la pollinisation. Placez l&#39;étiquette dans le même sac des graines. Les graines qui ont des marques rouges sur les deux côtés représentent les graines qui ont résulté de la croix génétique contrôlée. Ceux-ci sont censés être retrempe descendance. </li><li> Jetez les graines sans marques rouges car ils représententles graines qui résultent de fleurs nouvellement développés après la castration. Graines avec des marques rouges sur une seule face représenteront probablement les graines issues de l&#39;auto-pollinisation car ils n&#39;étaient pas en fleurs au moment où les croisements contrôlés ont été effectués. </li><li> Les graines sèches à 30 ° C pendant 2 jours dans un séchoir à graines. Séché magasin de graines dans le laboratoire (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, humidité relative: 21,79% ± 1,15%) ou dans une chambre de semences (T: 4,0 ° C ± 1,0 ° C, humidité relative: 20% ± 1%). </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Importance du traitement avant l&#39;aube Pour obtenir une fréquence élevée de descendance retrempe il est essentiel d&#39;avoir la floraison très synchrone des parents masculins et féminins. Initialement, nous roulions régimes de température et de lumière (31 ° C/22 ° C, jour / nuit) et utilisé le S. viridis adhésion A10.1 pour tous les pollinisations. Dans ces conditions, la plupart des fleurs s&#39;ouvrent tôt le matin avant que la température monte à 31 ° C, bien que quelques fleurs s&#39;ouvrent de façon aléatoire entre 08h00-8: 12 heures. Des études antérieures dans S. italica indiquent que l&#39;heure du jour, le lieu et la saison contribuent à la variation de l&#39;anthèse 7,15,16. Siles et al. 6 noté que la floraison a été associée à des changements rapides de température et d&#39;humidité, mais pas à basse température et une humidité élevée, en soi, comme l&#39;a conclu dans des études antérieures 7,15. Par conséquent, nous avons utilisé un traitement par le froid avant l&#39;aube du 15 ° C pendant 30 min (à partir de 8:30 AM-9: 00 heures) pour imiterl&#39;état naturel avant l&#39;aube. Ce traitement par le froid avant l&#39;aube aidé à synchroniser la floraison chez les parents. Nous avons observé que, malgré la mise de la chambre pour les niveaux d&#39;humidité relative de 50%, l&#39;humidité relative à l&#39;intérieur de la chambre augmente jusqu&#39;à un niveau supérieur à 70% lorsque la température est passée de 22 ° C à 15 ° C et a continué à rester au-dessus de 70% jusqu&#39;à ce que la température progressivement augmenté à 31 ° C après 09h30. A 09h00, émasculé parents femelles et plantes de parent mâle sont amenés au laboratoire (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, humidité relative: 21,79% ± 1,15%). Fleurs des parents mâles commencent ouverture autour de 10h10, et la pollinisation peuvent être effectués à 10h30-11: 00 heures. Une liste détaillée de tous les réactifs et le matériel est fourni dans le tableau 2. Importance de la préparation de la panicule pour émasculation Dans les conditions de la chambre dans cette étude (figure 1), la durée de floraison de la panicule primaire variait de2-3 jours. Typiquement, les fleurs situés sur le milieu distale de l&#39;inflorescence (Figure 2A) et la première ouverture ouverte précède proximale et distale. Le nombre idéal de fleurs à retenir sur la panicule est de 20-30. Il faut être prudent lors de l&#39;enlèvement des fleurs immatures de sorte que seules les fleurs bien développées (la fleur la plus haute ou plus grands sur l&#39;épillet 17) sont conservés. Étiquetage avec un marqueur rouge sur les deux côtés des fleurs permet de distinguer efficacement progéniture retrempe putatif à partir de graines de fleurs nouvellement développés après la castration. En outre, il est important de laisser les poils sur les panicules avant émasculation pour protéger les fleurons de dommages importants à la chaleur, mais comme une option, ils peuvent être enlevés après la castration à l&#39;aide des ciseaux à ressort pour faciliter la pollinisation, en particulier lors de la liaison d&#39;une panicule technique est utilisée (figures 2C et 2D). Optimisé une températurela durée du traitement de d pour le traitement de l&#39;eau tiède La base de l&#39;émasculation par trempage de l&#39;eau chaude est que le pollen est plus sensible à la chaleur que la surface du stigmate. Toutefois, la durée et la température de traitement thermique peuvent varier selon les espèces et les adhésions Setaria. En général, une température plus élevée avec un temps de traitement plus courts ou plus basse température avec une durée de traitement plus longue aura le même effet sur la castration. Il a été rapporté qu&#39;un traitement thermique de 42 ° C pendant 20 min à 10 ou 47 ° C pendant 10 min 14 rendu S. italica pollen non viable, mais l&#39;efficacité de ces traitements n&#39;a pas été déterminée. Nous avons développé notre protocole suivant l&#39;hypothèse que, sous une température optimale et la durée du traitement, le pollen de toutes les fleurs retenue sur le parent femelle sera non viable tout stigmates resteront ouverts. Cependant, après la comparaison et l&#39;analyse des effets de plusieurs températures etpériodes de traitement (tableau 1), nous avons constaté que la sensibilité au traitement thermique varie parmi les fleurs retenues sur chaque panicule, donc il est difficile d&#39;éliminer complètement graines issues de l&#39;auto-pollinisation. Nous concluons que l&#39;efficacité de production de la descendance retrempe est le plus grand lorsque les traitements sont effectués à 48 ° C pendant 3-6 min dans S. viridis adhésion A10.1. Heure de pointe de la floraison et la pollinisation croisée Quand les fleurs arrivent à maturité et sont sur ​​le point d&#39;ouvrir, anthères sont blanc jaunâtre et le pollen est libéré dès que les anthères exsert des fleurs 8. Anthères se tournent progressivement brun après la libération du pollen que les fleurs commencent à se fermer. Une fois libérée, la viabilité du pollen est inconnue. Par conséquent, il est essentiel d&#39;utiliser le pollen de l&#39;ouverture ou des fleurs fraîchement ouvertes sur le parent mâle le plus tôt possible. Dans nos conditions de chambre (figure 1), la majorité des flowers des parents mâles commencent à s&#39;ouvrir à 10h10 et les fleurs ouvertes apportent le pollen à 10h30. Ainsi, la fenêtre souhaitable pour effectuer la pollinisation est 10:30-11:00. Les stigmates restent en dehors des glumes après fleurs se ferment et peuvent être réceptif au pollen. Cela a déjà été observé et confirmé dans S. italica que les stigmates sont réceptifs pendant environ 48 heures après l&#39;ouverture des fleurs par Siles et al. 6, il est donc important de sac panicules après le traitement thermique et après avoir effectué des croisements contrôlés. Comme indiqué plus haut, nous recommandons pollinisations performants à la fois sur Jour 2 et Jour 3 post-castration. Méthodes pour la pollinisation Nous avons comparé l&#39;efficacité de trois techniques de pollinisation. Si la floraison des fleurs ne sont pas limitatifs, la pollinisation panicule à panicule est la technique la plus efficace et donnera un plus grand nombre de descendants retrempe. Si panicules fleurissent limitent, une fréquence plus élevée de outcross progéniture sera produit lorsque la méthode anthères à la stigmatisation est utilisé. Nous avons obtenu la descendance retrempe des deux méthodes avec succès. La méthode «panicules de liaison&quot; a été utilisé dans la traversée S. italica 6 mais nous avons trouvé que cette méthode soit la méthode la moins efficace que la fenêtre de temps pour la libération du pollen du parent mâle est courte. En outre, il ya moins de contrôle sur la pollinisation et les poils sur S. panicules viridis peuvent également entraver la circulation du pollen sur le stigmate. Graine récolte, de séchage et de stockage Après la récolte, les graines doivent être séchés à 30-33 ° C pendant 2 jours. Anthecium devraient être supprimés pour la coloration GUS, si nécessaire. Les graines doivent être stockés dans un endroit frais et sec (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, humidité relative: 21,79% ± 1,15%) pour le stockage à court terme (moins de deux ans) ou dans une chambre de semences (T: 4.0 10 ° C ± 1,0 ° C, humidité relative: 20% ± 1%) pour un stockage à long terme.Mauvaises conditions de stockage peuvent entraîner des taux de viabilité faible 8. Nous avons observé que le taux de germination de S. viridis A10.1 est d&#39;environ 5% lorsque ensemencées 4 jours après la récolte, mais peut être augmentée de 90 à 96% après stockage dans le laboratoire (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, humidité relative: 21,79% ± 1,15%) pour 110 jours post-récolte suivie d&#39;une stratification de trois jours à -80 ° C pour lever la dormance des semences. Pour la stratification à -80 ° C, les graines sèches peuvent être placés dans un récipient étanche à l&#39;air (par exemple, des tubes de micro-centrifugeuse ou d&#39;une enveloppe de pièces de monnaie dans un sac en plastique scellé) et conservés à -80 ° C pendant 3 jours avant la plantation. Après 16 mois de stockage dans le laboratoire (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, humidité relative: 21,79% ± 1,15%), les pourcentages de germination de 90-95% peuvent encore être obtenus. En outre, pour rompre la dormance, les graines peuvent être séchés à 30-33 ° C pendant 2 jours après la récolte, et ensuite remis stratification de trois jours à -80 ° C suivie de l&#39;élimination deanthecium avant la plantation. Après ces traitements, semences taux allant jusqu&#39;à 33% de germination peuvent être atteints. Avantages, limites et modifications possibles Ici, nous fournissons le premier protocole standard pour effectuer des croisements en S. viridis A10.1 à l&#39;aide d&#39;un traitement thermique pour la castration. Contrairement à la castration physique, ce protocole est moins invasive et relativement facile à mettre en place dans un laboratoire. Cela prend habituellement environ 15 min pour couper un panicule et environ 15 panicules peut être coupé et traversé / personne / jour. En supposant une moyenne de 3-5 retrempe progéniture / panicule peut être récupéré dans des conditions optimisées, un total de 45 à 75 retrempe descendance peut être produite par une personne en un seul jour. En outre, cette technique peut être appliquée à d&#39;autres espèces en croix Setaria, bien que des optimisations supplémentaires seront susceptibles. Si l&#39;espace de la chambre de croissance est limitée, les plantes peuvent être cultivées en serre ou chambres de croissance sans traités avant l&#39;aubetiment jusqu&#39;à la panicule émerge avant qu&#39;ils ne soient transférés dans les conditions de la chambre optimisés.

S. viridis est un NADP-ME-type C 4 herbe étroitement liée à l&#39;alimentation de la bioénergie actions panic raide (NAD-ME sous-type), la récolte de céréales millet, et la mauvaise herbe agricole herbe de Guinée 5. Le génome de 510 Mb de forme cultivée de Setaria, S. italica, a récemment été séquencé 1,2 et une séquence du génome 25x de couverture de la mauvaise herbe apparentée, S. viridis, est en cours (non publié). S. viridis a un certain nombre de caractéristiques qui le rendent potentiellement excellent système génétique modèle, y compris un temps de génération rapide, petite taille, les besoins de croissance simples, et la production de semences prolifique 3. Surtout, des méthodes ont été développées récemment pour les transformation transitoire et stable de S. viridis qui offrent la possibilité de créer des plantes transgéniques 4. Cependant, un obstacle majeur dans le développement d&#39;outils génétiques pour S. viridis est son recalciTrance à pollinisation croisée. À ce jour, aucun protocole standard a été publiée qui permettra la production rapide de graines de croisements contrôlés. Croisements génétiques dans S. italica sont généralement effectuées par émasculation par la suppression des anthères des fleurs 6,7,8 ou par traitement thermique de fleurs de parents femelles 9-11. Suite à ces traitements, anthères ou panicules de fleurs non traitées / parents mâles sont légèrement poncées contre les stigmates de libération du pollen. En émasculation, anthères sont enlevés à l&#39;aide de pinces fines immédiatement après le fleuron s&#39;ouvre et l&#39;anthère commence à exsert, mais n&#39;a pas encore émis du pollen 6-8. Parmi les défis de cette dernière méthode est la difficulté dans l&#39;exercice de la castration dans un intervalle de temps étroite entre l&#39;ouverture et la libération du pollen de la fleur. La durée d&#39;ouverture et la fermeture d&#39;une seule fleur peut varier en fonction de l&#39;adhésion et l&#39;état de l&#39;environnement, et peut varier de 7 min &lt;sup&gt; 6 à 2,5 h 12 à S. italica. Depuis effusion de pollen se produit comme anthères exsert du fleuron, anthères doivent être enlevés soigneusement et rapidement, et donc, il est difficile d&#39;éviter la contamination due à l&#39;auto-pollinisation. En outre, comme la pollinisation sont effectuées immédiatement après la castration, le nombre de croix qui peuvent être exécutées par personne / jour est limitée. Comme méthode alternative, panicules matures peuvent être trempées dans l&#39;eau chaude pour chauffer-tuer le développement des grains de pollen 9,10,13,14 avec l&#39;avantage d&#39;effectuer des croix sur un grand nombre de panicules. Cependant, la température et la durée du traitement thermique varie largement d&#39;expériences différentes (par exemple 47 ° C pendant 10 min et 14 42 ° C pendant 20 min 10). En outre, aucune des analyses systématiques sur l&#39;efficacité de emasculations de chaleur médiation ont été publiées. Ainsi, une norme et méthode simple pour effectuer des croisements génétiques dans S. viridis serait grandement accélérer le développement des ressources génétiques et l&#39;établissement de S. viridis comme un système de modèle au sein de la communauté de la recherche. Nous rapportons le développement et l&#39;optimisation d&#39;un protocole standard pour effectuer des croisements génétiques dans S. viridis. Les plantes sont cultivées dans des environnements contrôlés à synchroniser le développement des fleurs et d&#39;augmenter la reproductibilité de la procédure. Croix sont effectuées en utilisant un S. transgénique ligne viridis parent mâle contenant le gène rapporteur GUS 4 à faciliter l&#39;identification des croisements génétiques contrôlés avec succès. Le transgène GUS est entraînée par un promoteur de l&#39;ubiquitine du riz qui permet au ballon de graines F1 immédiatement après la récolte et fournit ainsi un dosage qualitatif facile de déterminer l&#39;efficacité de la castration et la pollinisation. Nous avons utilisé un simple traitement thermique avec de l&#39;eau chaude pour l&#39;émasculation accompagnée par l&#39;étiquetage des fleurs qui ont été emasculated pour éliminer les graines résultant de fleurs nouvellement développés après la castration. Après avoir testé une série de traitements thermiques à des températures permissives et varier la durée de trempage dans l&#39;eau chaude, nous avons établi une température et de temps optimales durées de 48 ° C 3-6 min. Un traitement par le froid avant l&#39;aube a été trouvé pour promouvoir la floraison synchrone dans les deux parents afin de faciliter la pollinisation croisée. Nous avons également discuté des étapes clés dans le protocole et l&#39;application future de cette méthode à d&#39;autres adhésions Setaria.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Cat. Number</td>
 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Scissors, spring</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc</td>
			<td>14126</td>
		<td></td>	
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Forceps, Dumostar Biology Polished</td>
			<td>SPI Supplies</td>
			<td>TD5BP-XD</td>
		<td></td>	
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>F.S.T (Fine Science Tools)</td>
			<td>14005-12</td>
		<td></td>	
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Europack Clear Polypropylene Micro-Perforated Crusty Bread Bags 6"x28"</td>
			<td><a href="http://www.pjpmarketplace.com" target="_blank">http://www.pjpmarketplace.com</a></td>
			<td>361001</td>
 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Flats</td>
			<td>T.O. Plastics</td>
			<td>715401C </td>
			<td></td>	
		 </tr>
		 <tr>
			<td>metro mix 360</td>
			<td>Hommert International</td>
			<td>10-0356-1</td>
			<td></td>	
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Jack's 15-16-17</td>
			<td>Hommert International</td>
			<td>07-5925-1</td>
			<td></td>	
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>	
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sharpie Ultra Fine Point Permanent Markers, Red</td>
			<td>Staples</td>
			<td>37002</td>
 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Donegan DA-10 OptiVisor Headband Magnifier, 3.5x Magnification, 4" Focal Length</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>DA-10, B0015IP380</td>
 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>12"24/7 Packaging Hand Impulse Sealer Heat Seal Machine Poly Sealing Free Element Grip </td>
			<td>Amazon</td>
			<td>N/A</td>
 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>water bath</td>
			<td>VWR scientific</td>
			<td>Model: 1166</td>
			<td></td>	
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BDW walk in plant growth chamber</td>
			<td>Conviron</td>
			<td>BDW 40</td>
 <td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

methods for performing crosses in setaria viridis, a new model system for the grasses

Setaria viridis est un système modèle émergent de graminées C 4. Elle est étroitement liée à l&#39;alimentation de la bioénergie actions panic raide et la récolte de céréales millet. Récemment, le génome de 510 Mb de millet, S. italica, a été séquencé 1,2 et une séquence du génome 25x de couverture du rapport S. mauvaises herbes viridis est en cours. S. viridis a un certain nombre de caractéristiques qui le rendent potentiellement excellent système génétique modèle, y compris un temps de génération rapide, petite taille, les besoins de croissance simples, la production de semences prolifique 3 et systèmes développés pour la transformation à la fois transitoire et stable 4. Cependant, la génétique de S. viridis est largement inexploré, en partie, en raison de l&#39;absence de méthodes détaillées pour effectuer les croisements. À ce jour, aucun protocole standard a été adopté qui permettra la production rapide de graines de croisements contrôlés. La pression de protocoleENTED ici est optimisée pour effectuer des croisements génétiques dans S. viridis, adhésion A10.1. Nous avons utilisé un simple traitement thermique avec de l&#39;eau chaude pour la castration après la taille de la panicule de conserver 20-30 fleurons et l&#39;étiquetage des fleurs pour éliminer les graines résultant de fleurs nouvellement développés après la castration. Après avoir testé une série de traitements thermiques à des températures permissives et en faisant varier la durée d&#39;immersion, nous avons établi une température optimale et la plage de temps de 48 ° C pendant 3-6 min. En utilisant cette méthode, un minimum de 15 croix peut être réalisée par un seul ouvrier et par jour et une moyenne de 3 à 5 progéniture retrempe par panicule peut être récupéré. Par conséquent, une moyenne de 45 à 75 retrempe descendance peut être produite par une personne en un seul jour. Une large application de cette technique sera de faciliter le développement des populations de lignées recombinantes de S. viridis X S. viridis ou S. viridis X S. italica, la cartographie des mutations par nombre seanalyse gregant et créer des mutants d&#39;ordre supérieur pour l&#39;analyse génétique.

Dans cette étude, nous avons utilisé la séquence S. viridis adhésion A10.1 comme parent femelle, et un S. transgénique ligne viridis (également A10.1) contenant le gène rapporteur GUS 4 comme parent mâle pour tous les pollinisations. Un régime de croissance optimisée a été utilisé pour synchroniser la floraison comme représenté sur la figure 1. Nous avons testé plusieurs combinaisons de température et le temps de traitement thermique pour la castration et observé qu&#39;environ 40-80% des fleurs retenues sur la panicule émasculé fleuri sur le 2 ème jour, alors que le reste a fleuri sur le 3 ème jour (Figure 2). Toutefois, si le traitement thermique était trop sévère, pour un exemple, 49 ° C pendant 4 min, très peu ou pas de fleurs a fleuri sur le 2 ème jour. Pollinisation croisée a été réalisée sur la 2 e ou 3 e jour après la castration, qui dépendait de l&#39;heure de pointe de la floraison des parents de sexe masculin. Il était observableed que les jeunes fleurs ont continué à se développer après la castration, mûri et l&#39;auto-pollinisation pollinisation 3-6 jours après contrôle. Après 7-10 jours après la pollinisation, les fleurs qui sont de couleur blanche sont visibles sur la panicule. Ces fleurs blanches ne sont pas fécondés en raison soit de dommages de la chaleur ou une mauvaise pollinisation. Dans le même temps, les fleurs qui ont été pollinisées avec succès commencent à porter leurs graines sombres et commencer à briser après 14 jours. Les graines noires avec des marques rouges récoltés sur le 14 e jour après la pollinisation pourraient être clairement distingués des graines sans marques rouges qui étaient encore vertes et ne se brisent. Si la récolte est retardée, la anthecium des graines avec et sans taches rouges à la fois tourner sombre, ce qui rend difficile de distinguer rapidement les graines avec des marques rouges dans les piscines récoltés. Afin d&#39;optimiser le protocole de traversée de plusieurs expériences de traitement thermique ont été réalisés comme le résume le tableau 1. Une moyenne de0 à 10 grains / panicule ont été récupérés à partir de différentes expériences de traitement thermique. Après la récolte, les graines ont été séchées à 30 ° C pendant 2 jours dans un séchoir à graines, suivie par l&#39;élimination de la anthecium l&#39;aide d&#39;un solvant de anthecium. Après la anthecium a été retiré, les graines F1 putatifs ont été colorées avec une solution de coloration GUS, et la descendance retrempe colorées couleur bleue dans 1-2 heures (figure 2F). Sur la base de ces résultats, nous recommandons un traitement thermique de 48 ° C pendant 3-6 min. En outre, nous recommandons que les croisements sont effectués à la fois sur les jours 2 et 3 ci-dessous émasculation. D&#39;examiner l&#39;efficacité de cette technique dans l&#39;exécution de croix avec d&#39;autres adhésions Setaria ou des espèces, des croisements entre S. viridis A10.1 et huit diversifiée S. adhésions viridis et un S. pumila adhésion ont été réalisées. Bien jours à la floraison variée parmi les accessions nous avons trouvé que les fleurs de tous les huit S. adhésions viridis et un S.pumila adhésion commencent ouverture entre 10h00-11h00 avec un temps d&#39;ouverture de pic à 10:20-11:00 après le traitement par le froid avant l&#39;aube. Ceci indique que le traitement à froid avant l&#39;aube peut être appliquée à divers Setaria adhésions. Un traitement thermique de 48 ° C pendant 5-6 min a été utilisé pour émasculer S. viridis A10.1 qui a été utilisé comme parent femelle pour tous les croisements effectués. Nous avons récupéré de l&#39;un à 12 graines de croisements entre A10.1 et trois de la diversité S. adhésions viridis et six graines d&#39;un seul croisement entre S. viridis A10.1 et un seul S. adhésion pumila. Cependant, à ce moment, nous n&#39;avons pas déterminé si ces semences résulte d&#39;une testcross succès ou sont le résultat de l&#39;auto-contamination. Quoiqu&#39;il en soit, ces résultats préliminaires suggèrent que les conditions de croissance utilisées pour S. viridis A10.1 peut être utilisé pour générer des croisements avec divers S. adhésions viridis et éventuellement d&#39;autres espèces de Setaria. <table border = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td> Temp traitement thermique (° C) </td><td> Temps traitement thermique, (min) </td><td> # croix </td><td> Moy. Nombre de fleurs après garniture </td><td> Jour de la pollinisation (jour après emasc) </td><td> Moy. # graines (rouge) / panicule (moyenne) </td><td> Moy. Gus% (+) / graines (rouges) </td><td> Moy. # Graines de hyb (Gus +) </td><td> Min # hyb graines </td><td> Max # hyb graines </td></tr><tr><td> 47 </td><td> 10 </td><td> 2 </td><td> 27 </td><td> 2ème jour </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 48 </td><td> 3 </td><td> 3 </td><td> 36 </td><td> 2ème jour </td><td> 5 </td><td> 60 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 5 </td></tr><tr><td></td><td> 4</td><td> 3 </td><td> 25 </td><td> 3ème jour </td><td> 10 </td><td> 50 </td><td> 5 </td><td> 3 </td><td> 7 </td></tr><tr><td></td><td> 5 </td><td> 8 </td><td> 25 </td><td> 2ème jour </td><td> 5 </td><td> 60 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 6 </td></tr><tr><td></td><td> 6 </td><td> 3 </td><td> 25 </td><td> 2ème jour </td><td> 4 </td><td> 75 </td><td> 3 </td><td> 0 </td><td> 4 </td></tr><tr><td></td><td> 7 </td><td> 4 </td><td> 24 </td><td> 2ème jour </td><td> 3 </td><td> 33 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 4 </td></tr><tr><td></td><td> 7 </td><td> 1 </td><td> 25 </td><td> 3ème jour </td><td> 4 </td><td> 75 </td><td> 3 </td><td> N / A </td><td> N /A </td></tr><tr><td> 49 </td><td> 1 </td><td> 3 </td><td> 23 </td><td> 2ème jour </td><td> 5 </td><td> 25 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 2 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 7 </td><td> 26 </td><td> 2ème jour </td><td> 8 </td><td> 25 </td><td> 2 </td><td> 0 </td><td> 4 </td></tr><tr><td></td><td> 3 </td><td> 5 </td><td> 22 </td><td> 2ème jour </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 1 </td></tr><tr><td></td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 25 </td><td> 2ème jour </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Optimisation du traitement thermique de la castration. Résultats de modifier à la fois la température et le temps de traitement thermique. Pollinisations ont été réalisées un (2ème jour) ou deux jours (3 ème jour) après la castration et croisements réussis sfourrés coloration GUS <img alt="Figure 1" fo:content-src="/files/ftp_upload/50527/50527fig1highres.jpg" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50527/50527fig1.jpg" /> Figure 1. Optimisé conditions de la chambre de croissance avec une température et des périodes de temps pour une croissance optimale et la synchronie de la production de fleurs avant l&#39;aube traitement par le froid. Sont indiqués. Les flèches vertes et rouges indiquent fenêtre optimale pour effectuer les croisements et la castration, respectivement. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/50527/50527fig2.jpg" /> Figure 2. préparation de la panicule de passage et la coloration GUS de descendance retrempe. (A) Une panicule de Setaria viridis A10.1 avant de couper, montrant environ 1/10 de fleurs ouvertes. Les quatre sections et directivité dans la progression de la floraison le long de la panicule est montré. <strongPanicule&gt; (B) Une garni avant la castration avec des poils retenus. (C) Une panicule émasculé après l&#39;enlèvement de poils. (D) Une panicule émasculé le jour 2 post-castration, montrant des fleurs qui fleurissent (photo prise à 10h30 AM). (E) Une panicule de parent mâle (Setaria viridis transgénique de la ligne de A10.1 portant une β-glucuronidase (GUS) gène rapporteur) qui est en pleine floraison après le traitement avant l&#39;aube (photo prise à 10h30). A à E, barres d&#39;échelle = 1 mm (F). progéniture retrempe putatif après coloration GUS pendant 2 heures suivi par distaining à 70% (v / v) d&#39;éthanol. Les deux graines de la droite sont des témoins négatifs et positifs, respectivement. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/50527/50527fig3.jpg" /> Figure 3. Organigramme du protocole Une représentation schématique de la métapes AJOR impliqués dans l&#39;exécution de S. viridis traverse.

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Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses

Nous avons développé une méthodologie pour effectuer des croisements dans viridis Setaria viridis (S.). Le procédé consiste à tailler la panicule préalable à un traitement à l&#39;eau chaude pour tuer pollen viable. Croix sont effectuées suivant un régime de croissance bien maîtrisée et aboutissent généralement à la reprise de 1 à 7 pollinisation croisée semences / s par panicule.

Méthodes pour effectuer des croix dans<em&gt; Setaria viridis</em&gt;, Un nouveau système modèle pour les graminées

Setaria viridis is an emerging model system for C4 grasses. It is closely related to the bioenergy feed stock switchgrass and the grain crop foxtail ...

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Environment

Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses

21.5K vues.  Donald Danforth Plant Science Center.  Nous avons développé une méthodologie pour effectuer des croisements dans viridis Setaria viridis (S.). Le procédé consiste à tailler la panicule préalable à un traitement à l'eau chaude pour tuer pollen viable. Croix sont effectuées suivant un régime de croissance bien maîtrisée et aboutissent généralement à la reprise de 1 à 7 pollinisation croisée semences / s par panicule. 

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Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues comprising the Caribbean reef building corals Montastraeaannularis and M. faveolata. These approaches include fluorescence microscopy (FM), serial block face imaging (SBFI), and two-photon confocal laser scanning microscopy (TPLSM). SBFI provides deep tissue imaging after physical sectioning; it details the tissue surface texture and 3D visualization to tissue depths of more than 2 mm. Complementary FM and TPLSM yield ultra-high resolution images of tissue cellular structure. Results have: (1) identified previously unreported lobate tissue morphologies on the outer wall of individual coral polyps&#160;and (2) created the first surface maps of the 3D distribution and tissue density of chromatophores and algae-like dinoflagellate zooxanthellae endosymbionts. Spectral absorption peaks of 500 nm and 675 nm, respectively, suggest that M. annularis and M. faveolata contain similar types of chlorophyll and chromatophores. However, M. annularis and M. faveolata exhibit significant differences in the tissue density and 3D distribution of these key cellular components. This study focusing on imaging methods indicates that SBFI is extremely useful for analysis of large mm-scale samples of decalcified coral tissues. Complimentary FM and TPLSM reveal subtle submillimeter&#160;scale changes in cellular distribution and density in nondecalcified coral tissue samples. The TPLSM technique affords: (1) minimally invasive sample preparation,&#160;(2) superior optical sectioning ability,&#160;and (3) minimal light absorption and scattering, while still permitting deep tissue imaging.

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine polyp morphology and tissue structure in the Caribbean corals Montastraeaannularis and M. faveolata. Fluorescence, serial block face,&#160;and two-photon confocal laser scanning microscopy have identified lobate structure, polyp walls, and estimated chromatophore and zooxanthellae densities and distributions.

Multimodales méthodes optiques Microscopie Reveal Polyp tissus Morphologie et structure dans Caribbean Reef construction Coraux

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues ...

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A New Application of the Electrical Penetration Graph (EPG) for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

Electrophysiological properties of cells are often studied in vitro, after dissociating them from their native environments. However, the study of electrical transmission between distant cells in an organism requires in vivo, artifact-free recordings of cells embedded within their native environment. The transmission of electrical signals from wounded to unwounded areas in a plant has since long piqued the interest of botanists. The phloem, the living part of the plant vasculature that is spread throughout the plant, has been postulated as a major tissue in electrical transmission in plants. The lack of suitable electrophysiological methods poses many challenges for the study of the electrical properties of the phloem cells in vivo. Here we present a novel approach for intracellular electrophysiology of sieve elements (SEs) that uses living aphids, or other phloem-feeding hemipteran insects, integrated in the electrical penetration graph (EPG) circuit. The versatility, robustness, and accuracy of this method made it possible to record and study in detail the wound-induced electrical signals in SEs of central veins of the model plant Arabidopsis thaliana1. Here we show that EPG-electrodes can be easily implemented for intracellular electrophysiological recordings of SEs in marginal veins, as well as to study the capacity of SEs to respond with electrical signals to several external stimuli. The EPG approach applied to intracellular electrophysiology of SEs can be implemented to a wide variety of plant species, in a large number of plant/insect combinations, and for many research aims.

A New Application of the Electrical Penetration Graph EPG for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

Electrical Penetration Graph (EPG) is a well-established technique for studying the feeding behavior of stylet-bearing insects. Here we show a new application of EPG as a non-invasive tool for the acquisition of intracellular electrophysiology recordings of sieve elements (SEs), the cells that form the phloem vasculature in plants.

Une nouvelle application de l&#39;électrique pénétration Graphique (EPG) pour l&#39;acquisition et la mesure des signaux électriques dans le phloème Sieve Elements

Electrophysiological properties of cells are often studied in vitro, after dissociating them from their native environments. However, the study of ...

Methods of Soil Resampling to Monitor Changes in the Chemical Concentrations of Forest Soils

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental changes. Repeated sampling to monitor these changes in forest soils is a relatively new practice that is not well documented in the literature and has only recently been broadly embraced by the scientific community. The objective of this protocol is therefore to synthesize the latest information on methods of soil resampling in a format that can be used to design and implement a soil monitoring program. Successful monitoring of forest soils requires that a study unit be defined within an area of forested land that can be characterized with replicate sampling locations. A resampling interval of 5 years is recommended, but if monitoring is done to evaluate a specific environmental driver, the rate of change expected in that driver should be taken into consideration. Here, we show that the sampling of the profile can be done by horizon where boundaries can be clearly identified and horizons are sufficiently thick to remove soil without contamination from horizons above or below. Otherwise, sampling can be done by depth interval. Archiving of sample for future reanalysis is a key step in avoiding analytical bias and providing the opportunity for additional analyses as new questions arise.

Repeated soil sampling has recently been shown to be an effective way to monitor forest soil change over years and decades. To support its use, a protocol is presented that synthesizes the latest information on soil resampling methods to aid in the design and implementation of successful soil monitoring programs.

Méthodes de rééchantillonnage du sol pour surveiller les changements dans les concentrations chimiques des sols forestiers

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes in elevation are related to changes in near-surface soil carbonate (CaCO3) profiles. The objective is to describe a simple conceptual model and detailed protocol for repeatable field and laboratory measurements of these quantities. Here, accurate elevation is measured using a ground-based differential global positioning system (GPS); other data acquisition methods could be applied to the same basic method. Soil samples are collected from prescribed depth intervals and analyzed in the lab using an efficient and precise modified pressure-calcimeter method for quantitative analysis of inorganic carbon concentration. Standard statistical methods are applied to point data, and representative results show significant correlations between changes in soil surface layer CaCO3 and changes in elevation consistent with the conceptual model; CaCO3 generally decreased in depositional areas and increased in erosional areas. Maps are derived from point measurements of elevation and soil CaCO3 to aid analyses. A map of erosional and depositional patterns at the study site, a rain-fed winter wheat field cropped in alternating wheat-fallow strips, shows the interacting effects of water and wind erosion affected by management and topography. Alternative sampling methods and depth intervals are discussed and recommended for future work relating soil erosion and deposition to soil CaCO3.

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes in elevation are related to changes in near-surface soil carbonates. Repeatable methods for field and laboratory measurements of these quantities and data analysis methods are described here.

Mesure et cartographie des schémas d’érosion et de dépôt liées aux Concentrations de Carbonate du sol sous gestion agricole

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

Methodology for Developing Life Tables for Sessile Insects in the Field Using the Whitefly, Bemisia tabaci, in Cotton As a Model System

Life tables provide a means of measuring the schedules of birth and death from populations over time. They also can be used to quantify the sources and rates of mortality in populations, which has a variety of applications in ecology, including agricultural ecosystems. Horizontal, or cohort-based, life tables provide for the most direct and accurate method of quantifying vital population rates because they follow a group of individuals in a population from birth to death. Here, protocols are presented for conducting and analyzing cohort-based life tables in the field that takes advantage of the sessile nature of the immature life stages of a global insect pest, Bemisia tabaci. Individual insects are located on the underside of cotton leaves and are marked by drawing a small circle around the insect with a non-toxic pen. This insect can then be observed repeatedly over time with the aid of hand lenses to measure development from one stage to the next and to identify stage-specific causes of death associated with natural and introduced mortality forces. Analyses explain how to correctly measure multiple mortality forces that act contemporaneously within each stage and how to use such data to provide meaningful population dynamic metrics. The method does not directly account for adult survival and reproduction, which limits inference to dynamics of immature stages. An example is presented that focused on measuring the impact of bottom-up (plant quality) and top-down (natural enemies) effects on the mortality dynamics of B. tabaci in the cotton system.

Methodology for Developing Life Tables for Sessile Insects in the Field Using the Whitefly, Bemisia tabaci, in Cotton As a Model System

Life tables allow quantification of the sources and rates of mortality in insect populations and contribute to understanding, predicting and manipulating population dynamics in agroecosystems. Methods for conducting and analyzing cohort-based life tables in the field for an insect with sessile immature life stages are presented.

Méthodologie pour l’élaboration des Tables de survie pour les insectes sessiles dans le champ à l’aide de l’aleurode, Bemisia tabaci, en coton comme modèle d’un système

Life tables provide a means of measuring the schedules of birth and death from populations over time. They also can be used to quantify the sources and ...

Techniques for Investigating the Anatomy of the Ant Visual System

This article outlines a suite of techniques in light microscopy (LM) and electron microscopy (EM) which can be used to study the internal and external eye anatomy of insects. These include traditional histological techniques optimized for work on ant eyes and adapted to work in concert with other techniques such as transmission electron microscopy (TEM) and scanning electron microscopy (SEM). These techniques, although vastly useful, can be difficult for the novice microscopist, so great emphasis has been placed in this article on troubleshooting and optimization for different specimens. We provide information on imaging techniques for the entire specimen (photo-microscopy and SEM) and discuss their advantages and disadvantages. We highlight the technique used in determining lens diameters for the entire eye and discuss new techniques for improvement. Lastly, we discuss techniques involved in preparing samples for LM and TEM, sectioning, staining, and imaging these samples. We discuss the hurdles that one might come across when preparing samples and how best to navigate around them.

This article outlines a suite of techniques in light and electron microscopy to study the internal and external eye anatomy of insects. These include several traditional techniques optimized for work on ant eyes, detailed troubleshooting, and suggestions for optimization for different specimens and regions of interest.

Techniques pour étudier l’anatomie du système visuel Ant

This article outlines a suite of techniques in light microscopy (LM) and electron microscopy (EM) which can be used to study the internal and external eye ...

Development of New Methods for Quantifying Fish Density Using Underwater Stereo-video Tools

The use of video camera systems in ecological studies of fish continues to gain traction as a viable, non-extractive method of measuring fish lengths and estimating fish abundance. We developed and implemented a rotating stereo-video camera tool that covers a full 360 degrees of sampling, which maximizes sampling effort compared to stationary camera tools. A variety of studies have detailed the ability of static, stereo-camera systems to obtain highly accurate and precise measurements of fish; the focus here was on the development of methodological approaches to quantify fish density using rotating camera systems. The first approach was to develop a modification of the metric MaxN, which typically is a conservative count of the minimum number of fish observed on a given camera survey. We redefine MaxN to be the maximum number of fish observed in any given rotation of the camera system. When precautions are taken to avoid double counting, this method for MaxN may more accurately reflect true abundance than that obtained from a fixed camera. Secondly, because stereo-video allows fish to be mapped in three-dimensional space, precise estimates of the distance-from-camera can be obtained for each fish. By using the 95% percentile of the observed distance from camera to establish species-specific areas surveyed, we account for differences in detectability among species while avoiding diluting density estimates by using the maximum distance a species was observed. Accounting for this range of detectability is critical to accurately estimate fish abundances. This methodology will facilitate the integration of rotating stereo-video tools in both applied science and management contexts.

We describe a new method for counting fishes, and estimating relative abundance (MaxN) and fish density using rotating stereo-video camera systems. We also demonstrate how to use distance from camera (Z distance) to estimate species-specific detectability.

Développement de nouvelles méthodes de quantification de la densité des poissons à l’aide d’outils de stéréo-vidéo sous-marine

The use of video camera systems in ecological studies of fish continues to gain traction as a viable, non-extractive method of measuring fish lengths and ...

A Novel Method for the Pentosan Analysis Present in Jute Biomass and Its Conversion into Sugar Monomers Using Acidic Ionic Liquid

Recently, ionic liquids (ILs) are used for biomass valorization into valuable chemicals because of their remarkable properties such as thermal stability, lower vapor pressure, non-flammability, higher heat capacity, and tunable solubility and acidity. Here, we demonstrate a method for the synthesis of C5 sugars (xylose and arabinose) from the pentosan present in jute biomass in a one-pot process by utilizing a catalytic amount of Br&#248;nsted acidic 1-methyl-3-(3-sulfopropyl)-imidazolium hydrogen sulfate IL. The acidic IL is synthesized in the lab and characterized using NMR spectroscopic techniques for understanding its purity. The various properties of BAIL are measured such as acid strength, thermal and hydrothermal stability, which showed that the catalyst is stable at a higher temperature (250 &#176;C) and possesses very high acid strength (Ho 1.57). The acidic IL converts over 90% of pentosan into sugars and furfural. Hence, the presenting method in this study can also be employed for the evaluation of pentosan concentration in other kinds of lignocellulosic biomass.

We present a protocol for the synthesis of C5 sugars (xylose and arabinose) from a renewable non-edible lignocellulosic biomass (i.e., jute) with the presence of Br&#248;nsted acidic ionic liquids (BAILs) as the catalyst in water. The BAILs catalyst exhibited better catalytic performance than conventional mineral acid catalysts (H2SO4 and HCl).

Une nouvelle méthode pour l’analyse de pentosane présente dans la biomasse Jute et sa transformation en monomères de sucre à l’aide d’acide liquide ionique

Recently, ionic liquids (ILs) are used for biomass valorization into valuable chemicals because of their remarkable properties such as thermal stability, ...

A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling

This protocol introduces a new in vitro exposure system, capable of being worn, including its characterization and performance. Air-liquid interface (ALI) in vitro exposure systems are often large and bulky, making transport to the field and operation at the source of emission or within the breathing zone difficult. Through miniaturization of these systems, the lab can be brought to the field, expediting processing time and providing a more appropriate exposure method that does not alter the aerosol prior to contacting the cells. The Portable In vitro Exposure Cassette (PIVEC) adapts a 37 mm filter cassette to allow for in vitro toxicity testing outside of a traditional laboratory setting. The PIVEC was characterized using three sizes of copper nanoparticles to determine deposition efficiency based on gravimetric and particle number concentration analysis. Initial cytotoxicity experiments were performed with exposed lung cells to determine the ability of the system to deposit particles while maintaining cell viability. The PIVEC provides a similar or increased deposition efficiency when comparing to available perpendicular flow in vitro exposure devices. Despite the lower sample throughput, the small size gives some advantages to the current in vitro ALI exposure systems. These include the ability to be worn for personal monitoring, mobility from the laboratory to the source of emission, and the option to set-up multiple systems for spatial resolution while maintaining a lower user cost. The PIVEC is a system capable of collecting aerosols in the field and within the breathing zone onto an air-interfaced, in vitro model.

A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling

Here, we present a protocol to perform portable cellular aerosol exposures and measure cellular response. The method uses cells, grown at the air-liquid interface, mimicking in vivo physiology. Cellular response to copper nanoparticle aerosols was observed as oxidative stress through reactive oxygen species generation and cytotoxicity as lactate dehydrogenase release.

Une nouveau Portable In Vitro exposition Cassette pour l’échantillonnage des aérosols

This protocol introduces a new in vitro exposure system, capable of being worn, including its characterization and performance. Air-liquid interface (ALI) ...

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

Stomatal movement mediates plant gas exchange, which is essential for photosynthesis and transpiration. Stomatal opening and closing are accomplished by a significant increase and decrease in guard cell volume, respectively. Because shuttle transport of ions and water occurs between guard cells and larger neighboring epidermal cells during stomatal movement, the spaced distribution of plant stomata is considered an optimal distribution for stomatal movement. Experimental systems for perturbing the spaced pattern of stomata are useful to examine the spacing pattern's significance. Several key genes associated with the spaced stomatal distribution have been identified, and clustered stomata can be experimentally induced by altering these genes. Alternatively, clustered stomata can be also induced by exogenous treatments without genetic modification. In this article, we describe a simple induction system for clustered stomata in Arabidopsis thaliana seedlings by immersion treatment with a sucrose-containing medium solution. Our method is easy and directly applicable to transgenic or mutant lines. Larger chloroplasts are presented as a cell biological hallmark of sucrose-induced clustered guard cells. In addition, a representative confocal microscopic image of cortical microtubules is shown as an example of intracellular observation of clustered guard cells. The radial orientation of cortical microtubules is maintained in clustered guard cells as in spaced guard cells in control conditions.

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

The goal of this protocol is to demonstrate how to induce clustered stomata in cotyledons of Arabidopsis thaliana seedlings by immersion treatment with a sugar-containing medium solution and how to observe intracellular structures such as chloroplasts and microtubules in the clustered guard cells using confocal laser microscopy.

Un système d’Induction de stomates groupées par traitement de Immersion de Solution de sucre chez les plantules de Arabidopsis thaliana

Stomatal movement mediates plant gas exchange, which is essential for photosynthesis and transpiration. Stomatal opening and closing are accomplished by a ...