Ce protocole fournit des connaissances pratiques, utiles pour formuler des particules à l’échelle nanométrique, c’est-à-dire des nanodisques, qui incorporent de manière stable un large éventail de molécules bioactives hydrophobes. Cette méthode a de nombreuses applications pratiques.
La capacité de conférer une solubilité aqueuse à des composés bioactifs autrement insolubles permet l’utilisation de nanodisques dans les applications d’administration de médicaments. La méthode décrite est simple. Il est préférable de mener des études à l’échelle décrite, cinq milligrammes de phospholipides, deux milligrammes de protéines d’échafaudage, de sorte que la formation de nanodisques soit facilement surveillée par inspection visuelle.
Michael Karo et Matthew Swackhammer, étudiants chercheurs de premier cycle au laboratoire Ryan, feront la démonstration de la procédure. Pour préparer une aliquote phospholipidique, peser cinq milligrammes de DMPC et la transférer dans un tube à essai en verre. Dissoudre le phospholipide en ajoutant 300 microlitres de chloroforme et 100 microlitres de méthanol pour un rapport de trois à un.
Évaporer le solvant organique en plaçant le tube à essai en verre sous un léger jet d’azote gazeux pendant 10 à 15 minutes, de sorte qu’une fine pellicule de phospholipides séchés se forme le long des parois de la partie inférieure du tube. Pour formuler des disques d’amphotéricine B ou d’AmpB-Nanodisks, pipeter 450 microlitres de PBS sur l’aliquote phospholipide lyophilisé et vorter pendant 30 secondes pour disperser le lipide. Pipeter 50 microlitres de 20 milligrammes par millilitre de solution mère d’AmpB dans l’échantillon de phospholipides dispersé et le vortex.
Ajouter 500 microlitres de protéine d’échafaudage ApoE4 NT de quatre milligrammes par millilitre au tube à essai en verre contenant le phospholipide dispersé et l’AmpB. Bain soniquer l’échantillon à 24 degrés Celsius jusqu’à ce que la solution se clarifie. Pour la dialyse AmpB-Nanodisk, préparez une section de tuyau de dialyse en le trempant soigneusement dans de l’eau distillée désionisée pendant 10 minutes.
À l’aide d’une pince de tuyau de dialyse, serrez une extrémité de la tubulure de dialyse trempée, en veillant à ce qu’aucun liquide ne puisse s’échapper. Insérez un entonnoir de col étroit dans l’extrémité ouverte du tube de dialyse et transférez l’échantillon AmpB-Nanodisk dans le tube de dialyse. Retirez l’entonnoir et serrez l’extrémité du tube de dialyse avec une autre pince de tube de dialyse.
Placez un flotteur de dialyse en mousse sur l’une des extrémités scellées du tube de dialyse et placez le tube de dialyse assemblé dans le bécher contenant un tampon PBS d’un litre fraîchement préparé. Placez une barre d’agitation magnétique dans le fond du bécher et réglez la commande d’agitation à basse température, en veillant à ne pas produire de vortex. Laissez la dialyse se poursuivre toute la nuit à quatre degrés Celsius.
Allumez le spectrophotomètre en actionnant l’interrupteur d’alimentation et connectez-vous à un ordinateur de support correspondant en appuyant sur Contrôle PC. Sur l’ordinateur de support, ouvrez le logiciel intitulé UVProbe 2.61 et connectez-vous au spectrophotomètre en cliquant sur connecter dans le coin inférieur gauche. Cliquez sur le spectre, puis cliquez sur méthode dans la barre d’outils supérieure.
Cliquez sur l’onglet de mesure et entrez 500 dans la zone de texte de début située sous la plage de longueurs d’onde et 300 dans la zone de texte de fin. Cliquez sur le menu déroulant à côté de l’onglet intitulé vitesse d’analyse » et réglez-le sur moyen. Préparer un blanc d’échantillon en transférant un millilitre de DMSO dans deux cuvettes de quartz.
Chargez les deux cuvettes dans les orifices d’échantillonnage respectifs du spectrophotomètre. Cliquez sur auto blank » et enregistrez un spectre de 300 à 500 nanomètres en cliquant sur Démarrer dans le coin inférieur gauche. Pour l’analyse spectrale standard AmpB, retirez la cuvette du port d’échantillonnage avant et ajoutez 20 microlitres d’un milligramme par millilitre de solution mère AmpB.
Rechargez la cuvette dans la carte d’échantillonnage et cliquez sur Démarrer pour enregistrer l’absorbance de l’échantillon. Après avoir enregistré l’absorbance de l’échantillon, retirer la cuvette et décanter le contenu liquide dans un récipient à déchets. Rincer soigneusement la cuvette avec trois lavages à l’eau désionisée, suivis de trois lavages à l’éthanol à 70%.
Pour l’analyse spectrale de l’AmpB-Nanodisque perturbé, préparez l’échantillon en pipetant 20 microlitres d’un milligramme par millilitre de stock AmpB-Nanodisk dans un millilitre de DMSO, et incuber pendant une minute avant d’enregistrer le spectre. Chargez la cuvette dans l’orifice d’échantillonnage avant et cliquez sur Démarrer pour enregistrer l’absorbance de l’échantillon. Pour l’analyse spectrale d’un blanc tampon PBS, préparez un blanc en transférant un millilitre de PBS dans deux cuvettes de quartz.
Chargez les cuvettes dans le port d’échantillonnage. Cliquez sur auto blank » et enregistrez le spectre de 300 à 500 nanomètres. Pour l’analyse spectrale d’un échantillon AmpB-Nanodisk non perturbé, retirez la cuvette du port d’échantillon avant et ajoutez 20 microlitres d’un échantillon AmpB-Nanodisk d’un milligramme par millilitre dans le tampon PBS.
Rechargez la cuvette dans la carte d’échantillonnage. Cliquez sur Démarrer et enregistrez l’échantillon de spectre. La réaction de formulation AmpB-Nanodisk est considérée comme terminée lorsque l’apparence de l’échantillon passe de trouble à clair.
La spectroscopie d’absorption visible UV d’échantillons AmpB dans le DMSO et le PBS est montrée. Dans le DMSO, trois maxima d’absorbance distinctifs à 372, 392 et 415 nanomètres, pics indicatifs de l’ampB, ont été observés. Les spectres d’absorbance des nanodisques AmpB dans le PBS ont montré un seul pic d’absorbance majeur à une longueur d’onde plus courte.
En comparaison, les spectres d’absorbance des AmpB-Nanodisques dans le DMSO semblaient similaires aux spectres des AmpB de stock. L’activité biologique des nanodisques AmpB a été réalisée en évaluant les tests d’inhibition de la croissance des levures. Des échantillons témoins comme le PBS, le DMSO et les lipoprotéines de haute densité reconstituées ont démontré que les composants des nanodisques autres que l’AmpB n’ont aucun effet perceptible sur la croissance des levures.
Le témoin positif a confirmé que l’AmpB est un inhibiteur efficace de la croissance des levures. Dans le cas des nanodisques AmpB, une activité d’inhibition de la croissance dépendante de la concentration a été observée. Toutes les préparations de nanodisques ne sont pas identiques.
Certains peuvent nécessiter plus de temps, des lipides différents ou des protéines d’échafaudage différentes. Ils ne sont qu’indistincts par la clarification de l’échantillon de nanodisque. Cette technique a conduit à de nouvelles nanoparticules utilisées pour étudier la cardiotoxicité induite par la doxorubicine, l’apoptose, les interactions avec les ligands, et a livré de nombreuses molécules bioactives insolubles aqueuses, y compris la lutéine et la curcumine.
