Les auteurs tiennent à remercier Mant Acon pour les plantes utilisées dans cette étude. Le financement a été fourni par le projet CRIS 8062-22410-007-000-D du département de l’Agriculture des États-Unis (USDA) et la subvention NIFA de l’USDA 2020-70029-33176.

1. Production d’agrumes destinés à l’injection expérimentale de composés
<ol><li>Multipliez les petits agrumes en pot à partir de boutures végétatives ou de graines enracinées. Cultivez les lignes d’agrumes en pot sous une longueur de jour clair/foncé de 16 h/8 h et à 28 °C.</li>
	<li>Sélectionnez des plants d’agrumes de la taille appropriée pour l’expérience. Les applications décrites exigeaient que les plantes aient entre 12 cm et 100 cm de hauteur avec des diamètres de tronc de 4 à 14 mm. Si une nouvelle croissance de chasse d’eau est nécessaire, coupez les plantes avant l’expérience.</li>
</ol>2. Impression tridimensionnelle du dispositif DPI et des composants du moule
<ol><li>Appliquez une fine couche de colle à base d’acétate de polyvinyle sur le lit d’impression.</li>
	<li>Chargez le filament de nylon dans l’imprimante 3D et préparez l’imprimante conformément aux instructions du fabricant. Importez le fichier . STL (fichier supplémentaire 1, dossier supplémentaire 2, dossier supplémentaire 3, dossier supplémentaire 4, dossier supplémentaire 5, dossier supplémentaire 6, dossier supplémentaire 7, dossier supplémentaire 8, dossier supplémentaire 9, dossier supplémentaire 10, dossier supplémentaire 11, dossier supplémentaire 12, dossier supplémentaire 13 et dossier supplémentaire 14), mise en place et lancez l’impression.</li>
	<li>Retirez la pièce du lit d’impression. Rincez la colle à base d’acétate de polyvinyle de la base du composant imprimé avec de l’eau et retirez toutes les structures de support.</li>
	<li>Vaporisez le composant DPI avec deux couches de peinture en aérosol brillante transparente.</li>
</ol>3. Fabrication du moule à anneau plastisol
<ol><li>Assemblez une forme de moule suffisamment grande pour contenir les pièces du motif en construisant une enceinte rectangulaire à l’aide de blocs de plastique encliquetables sur une base (figure supplémentaire S1A).</li>
	<li>Mélanger le monomère de silicone RTV et le catalyseur ensemble à un rapport de 10:1, et remuer sans introduire de bulles pendant 1 min. Colorer en ajoutant du colorant alimentaire (3 gouttes/25 mL de mélange de silicone) et du savon pour les mains (1 mL de savon/25 mL de mélange de silicone) (Figure supplémentaire S1B).</li>
	<li>Versez une fine couche de silicone dans la forme du moule qui est suffisante pour couvrir complètement le fond. Tamp pour aplatir la surface et attendre 24 h que le silicone durcisse (Figure supplémentaire S1C).</li>
	<li>Versez une deuxième couche de silicone, comme décrit ci-dessus, suffisamment profonde pour couvrir l’empreinte du noyau du trou central sur le motif (visible en haut du motif dans la figure supplémentaire S1D). Insérez le motif dans le silicone liquide avec l’impression du noyau du trou central vers le bas. Assurez-vous qu’aucune bulle n’est piégée et que les motifs sont bien séparés et ne se touchent pas (figure supplémentaire S1E).</li>
	<li>Fixez les motifs avec un objet lourd et / ou du ruban adhésif pour les empêcher de flotter hors du silicone pendant qu’il prend. Attendez 24 heures que la couche nouvellement coulée prenne (figure supplémentaire S1F).</li>
	<li>Versez des couches supplémentaires de silicone jusqu’à ce que le niveau affleure le haut du motif. Attendre 24 h pour guérir (Figure supplémentaire S1G).</li>
	<li>Démontez les blocs de plastique encliquetables pour libérer le moule. Supprimer les motifs (figure supplémentaire S1H). Inspectez la moisissure à la recherche de déchirures ou de déformations (figure supplémentaire S1I).</li>
</ol>4. Coulée des anneaux plastisols
<ol><li>Enduisez l’intérieur du moule, tous les composants principaux et les joints toriques d’huile de cuisson (figure supplémentaire S2A, B). Placez un joint torique autour de l’encoche au milieu du noyau du poteau central et placez le noyau dans le trou central du moule de l’anneau en plastisol (figure supplémentaire S2C).</li>
	<li>Insérez le noyau du canal de livraison dans le trou sur le côté du moule à anneau plastisol. Orientez l’extrémité en forme de V à l’extrémité du noyau du canal de distribution pour l’aligner sur le joint torique sur le noyau du poteau central (figure supplémentaire S2D,E).</li>
	<li>Faire chauffer le plastisol au micro-ondes pendant de courtes rafales de 10 s (Figure supplémentaire S2F, G). Remuer doucement le plastisol pour éviter les bulles (figure supplémentaire S2H). Répéter le chauffage et l’agitation jusqu’à ce que la solution atteigne une température comprise entre 160 °C et 170 °C (figure supplémentaire S2I). ATTENTION : La surchauffe du plastisol peut entraîner le dégagement de fumées toxiques. Effectuez la procédure dans un endroit bien ventilé ou une hotte. Ne pas chauffer le plastisol à plus de 170 °C.</li>
	<li>Verser le plastisol fondu dans le moule à anneau plastisol près du bord extérieur du moule sans introduire de bulles (Figure supplémentaire S2J). Attendez 1 h que les anneaux plastisols refroidissent (figure supplémentaire S2K). Retirez les anneaux du moule. S’assurer qu’il est bien ajusté avec le dispositif DPI avant de l’utiliser dans des essais expérimentaux (figure supplémentaire S2L).</li>
</ol>5. Fixation du dispositif DPI à l’usine
<ol><li>Trouvez un site lisse et sain sur le coffre pour la fixation de l’appareil. Évitez les bosses ou les nœuds, car ils peuvent contribuer aux fuites de l’appareil.</li>
	<li>Utilisez un foret de 2 mm de diamètre pour percer horizontalement un trou au centre de la tige à un angle de 90° avec la surface du tronc (figure supplémentaire S3A). Passez le foret à travers le trou plusieurs fois pour le nettoyer et le lisser afin de créer un trou dégagé (figure supplémentaire S3B).</li>
	<li>Créer une tranche verticale dans l’anneau plastisol du côté opposé du canal de distribution du composé (figure supplémentaire S3C). Ajustez l’anneau autour de la plante et alignez le canal de livraison avec le trou précédemment foré (figure supplémentaire S3D). REMARQUE: L’anneau doit être bien ajusté autour du coffre pour éviter les fuites; Des assemblages de noyaux de différents diamètres peuvent être utilisés pour fabriquer des anneaux de plastisol pour des tiges de plantes de différentes tailles.</li>
	<li>Ajoutez le dispositif DPI à l’anneau plastisol, en veillant à ce qu’ils s’emboîtent parfaitement. Alignez le bec du dispositif DPI avec le canal de distribution de l’anneau plastisol et le trou foré (figure supplémentaire S3E). REMARQUE: L’utilisation d’un foret pour aligner le trou et le bec du périphérique DPI peut être utile.</li>
	<li>Envelopper hermétiquement avec du ruban de silicone pour maintenir l’appareil en place (figure supplémentaire S3F). Inspectez l’appareil entièrement assemblé et fixé pour vous assurer d’un alignement et d’une orientation appropriés sur la plante.</li>
</ol>6. Application du composé d’intérêt à l’aide du dispositif DPI
<ol><li>Utiliser une seringue ou une pipette pour remplir le dispositif DPI avec la solution d’intérêt (figure supplémentaire S3G). Utilisez une seringue pour pénétrer le ruban de silicone et l’anneau de plastisol du côté opposé du dispositif DPI afin d’extraire l’air du canal intérieur et d’éviter l’introduction de bulles d’air dans le système vasculaire de la plante (figure supplémentaire S3H). Replacez tout composé extrait dans le périphérique DPI.</li>
	<li>Ajoutez un petit morceau supplémentaire de ruban adhésif de silicone sur le trou créé par la seringue pour renforcer la zone et prévenir les déchirures. Inspecter l’appareil pour détecter les fuites visibles au point de fixation et inspecter le réservoir de l’appareil pour vérifier s’il y a un niveau de liquide stable. NOTE: L’eau peut être utilisée initialement pour tester les fuites afin d’éviter le gaspillage de la solution d’essai.</li>
	<li>Couvrir l’extrémité ouverte du dispositif DPI avec un film d’étanchéité à la cire et tirer vers le bas pour former un joint et réduire l’évaporation du composé expérimental. Percez un seul trou dans le film de cire avec un embout de seringue pour éviter le développement d’un vide, puis remplissez le dispositif (figure supplémentaire S3I).</li>
	<li>Vérifiez quotidiennement l’appareil pour s’assurer du bon alignement des composants (figure supplémentaire S3J) et complétez le liquide à l’aide d’une seringue pour éviter que le réservoir ne s’assèche. Répétez ce processus jusqu’à ce que la quantité désirée de solution expérimentale ait été introduite. REMARQUE: Les composés peuvent être introduits avec succès à partir d’un dispositif donné jusqu’à 1 mois. Les durées d’absorption de la solution qui dépassent ce délai doivent être testées empiriquement avant la configuration expérimentale.</li>
</ol>7. Utilisation de CFDA pour observer le mouvement vasculaire avec les agrumes
<ol><li>Fixez l’appareil DPI à des plants de cédrat (Citrus medica L.) de 25 cm de haut, appliquez un seul traitement de 2,0 ml de DMSO à 20 % dans un contrôle H2O ou CFDA au dispositif DPI et laissez-le absorber pendant 24 h. Pour suivre ce protocole, préparez la solution de CFDA fonctionnelle en ajoutant 1,6 mL deH2Oà 400 μL de solution mère de CFDA (la solution mère contient 10 mM de CFDA dissous dans 100% de diméthylsulfoxyde [DMSO]) pour générer une concentration finale de CFDA de 2 mM et 20% de DMSO.</li>
	<li>Faites des coupes transversales de divers tissus de la plante et utilisez un stéréoscope ou un microscope composé avec un filtre fluorescent qui comprend la longueur d’onde de 498 nm pour visualiser le CFDA dans les tissus végétaux. Comparez les images au DMSO à 20 % dans les témoins H2O pour tenir compte de l’autofluorescence dans le tissu.</li>
</ol>8. Mesure des changements dans le titre CLas dans les échantillons de feuilles après un traitement à la streptomycine
<ol><li>À l’aide de plantes de Valence (Citrus sinensis (L .) Osbeck « Valencia ») infectées par CLas et cultivées en serre de 0,75 m de haut, prélever le pétiole et la nervure médiane de deux feuilles symptomatiques HLB de chaque plante, les couper en petites sections, regrouper chaque type de tissu et les stocker séparément dans des tubes d’échantillon résistants aux chocs de 2 ml contenant une bille d’acier de 6,35 mm de diamètre.</li>
	<li>Broyer l’échantillon à l’aide d’un homogénéisateur programmé pour deux cycles de 15 s à 3,4 m/s. Extraire l’acide nucléique total comme décrit précédemment19.</li>
	<li>Effectuer la qPCR sur les échantillons de feuilles infectés par CLas en utilisant le mélange qPCR défini dans le tableau 1 et les conditions de réaction définies dans le tableau 2. Utilisez des plantes présentant des infections CLas robustes (l’infection robuste est généralement définie comme des valeurs Ct basées sur la qPCR < 30 pour le jeu d’amorces CLas 16S LasLong (LL)) pour une analyse plus approfondie. REMARQUE : Le titre bactérien est estimé à l’aide des amorces de l’ADN de CLas 16S Las Long (LL) et de la déshydrine d’agrumes pour estimer les équivalents relatifs du génome, comme décrit précédemment20.</li>
	<li>Équiper les plants d’agrumes qui répondent au titre d’infection minimal décrit ci-dessus avec des dispositifs DPI et les soumettre à un traitement unique de 2,0 mL de solution H2O ou de solution de streptomycine à la concentration désirée. Pour suivre cette étude, utiliser un seul traitement de 2,0 mL de 9,5 mg/mL (19 mg au total) de streptomycine dissoute dans H2O.</li>
	<li>Prélever des échantillons de feuilles 7 jours, 14 jours et 28 jours après le traitement. Doser les feuilles échantillonnées pour le titre CLas en utilisant le même protocole que celui décrit ci-dessus.</li>
	<li>60 jours après le traitement, obtenir des photographies des plantes traitées avecH2Oou streptomycine. Utilisez des observations visuelles de l’infection CLas pour évaluer la gravité de l’infection. Recherchez <50% des feuilles présentant une chlorose internervaire et un bouchon veineux ainsi qu’une croissance de rinçage des feuilles comme signes d’infection bénigne et plus de 50% des feuilles présentant une chlorose internervaire et un bouchon veineux ainsi qu’une abscission foliaire et un retard de croissance de la plante comme signes d’infections plus graves.</li>
</ol>9. Mesure de la mortalité de D. citri après un traitement par imidaclopride
<ol><li>Tailler les plants de cédrat (Citrus medica L.) de 0,5 m de haut à une hauteur de 12 cm pour favoriser la croissance de nouvelles rougeurs. REMARQUE : La vitesse de croissance des chasses d’eau peut dépendre de la santé de la plante et de la période de l’année; Donc, tenez-en compte lors de la conception expérimentale.</li>
	<li>Après >6 chasses de 1 à 2 cm de long, introduisez les plantes dans des cages contenant du D. citri adulte. Laissez les plantes dans les cages pendant 24 h pour permettre le dépôt des œufs.</li>
	<li>Effectuer un comptage représentatif des œufs sur trois pousses rinçantes 1 à 2 jours après la ponte, puis appliquer les dispositifs DPI. Remplissez ces dispositifs avec 2,0 mL d’un témoin d’eau ou la concentration désirée d’imidaclopride (ingrédient actif à 21,8 %). Pour suivre ce protocole, utilisez 528 μL/L, 52,8 μL/L et 5,28 μL/L d’imidaclopride. REMARQUE : Le nombre d’œufs est une mesure destructrice, de sorte que les comptages à ce stade sont utilisés pour estimer le nombre d’œufs sur la chasse d’eau non comptée de la même plante et aider à fournir une base de référence pour les dénombrements ultérieurs d’émergence de nymphes qui sont effectués à la fin de l’expérience.</li>
	<li>Recueillir le taux d’émergence de D. citri sur au moins trois des pousses flush restantes. Acquérir des photographies de plantes représentatives 7 jours après l’introduction du composé.</li>
</ol>

Administration de molécules dans des plantes à l’aide d’un dispositif à infusion directe

<ol>
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Pour que le dispositif DPI soit considéré comme une méthode viable pour l’administration de composés exogènes dans les plantes, il doit contribuer à une absorption robuste et cohérente des composés dans divers types de tissus. L’expérience utilisant CFDA a clairement montré à la fois le mouvement des composés acropétaux et basipétals, ainsi que dans le système vasculaire et les cellules mésophylles de la feuille. De plus, et probablement parce que le trou foré utilisé dans ce dispositif DPI fournit une grande surface pour l’absorption du composé, le CFDA était présent en quantités relativement égales dans toutes les sections de la tige, et pas seulement dans un petit sous-ensemble du système vasculaire adjacent au dispositif, comme on l’a vu dans des études antérieures sur l’absorption de colorant chez des plantes utilisant l’injection de tronc6. De plus, l’administration de protéines fluorescentes vertes et de colorant floral a été testée à l’aide du dispositif DPI, et une distribution de ces composés similaire à celle du CFDA a été observée (données non présentées). Ces données suggèrent que le dispositif peut être utilisé pour délivrer systématiquement une variété de composés dont la taille et la structure moléculaire varient. Cependant, il convient de noter qu’il y avait des différences dans l’absorption des composés en fonction du stade de développement des feuilles, les jeunes feuilles en développement absorbant plus de composés que les feuilles établies plus âgées. Cela peut être dû aux changements dans les propriétés vasculaires présentes dans le tissu de l’évier par rapport au tissu source et devrait être optimisé pour une expérience donnée. 
Le dispositif DPI a montré une absorption suffisante de composés pour la visualisation de CFDA, GFP et colorant floral, et il a également pris suffisamment pour montrer les effets antibactériens et insecticides de la streptomycine et de l’imidaclopride, respectivement. Ces deux composés ont entraîné des changements dans la viabilité de l’organisme cible 1 semaine après un seul traitement de 2,0 mL. Ces données suggèrent que le dispositif DPI pourrait être utilisé dans des essais sur des plantes entières pour tester la viabilité d’une grande variété de composés pour la lutte contre les ravageurs microbiens et les insectes. De plus, en raison de son contact direct avec le système vasculaire, ce dispositif peut même être l’occasion de tester des composés qui ne sont pas absorbés efficacement par les racines ou les cellules épidermiques. L’interférence ARN (ARNi) serait particulièrement intéressante, car elle pourrait être utilisée pour moduler l’expression génique au sein de la plante hôte, de l’agent pathogène ou du vecteur pathogène. Des recherches antérieures qui ont introduit l’ARN en épingle à cheveux à travers un trou percé dans le tronc des plants de pomme et de raisin ont montré que les molécules d’ARN étaient limitées au tissu du xylème, ce qui suggère que ces molécules ne peuvent être efficaces que contre les organismes masticateurs et nourrisseurs de sève de xylème22. Étant donné que le dispositif DPI utilise un système d’administration de trous percés similaire, il va de soi que l’ARN en épingle à cheveux livré avec ce dispositif peut également être limité au tissu du xylème. Cependant, la diminution observée du titre des CLas limités par le phloème après le traitement à la streptomycine à partir du dispositif DPI suggère fortement que cet antibiotique était présent dans le phloème. Par conséquent, il est probable que la distribution vasculaire des composés délivrés à l’aide du dispositif DPI dépend de leur taille et de leur chimie, et chaque molécule doit être évaluée sur une base individuelle.
Bien qu’il existe un certain nombre d’appareils DPI disponibles dans le commerce disponibles sur le marché, l’appareil décrit ici peut être fabriqué en interne et est modifiable. De cette façon, des améliorations et des changements de taille peuvent être apportés en fonction de l’espèce végétale et du plan expérimental utilisé, et cela ne dépend pas de produits commerciaux. De plus, le dispositif est fixé de manière semi-permanente à la plante, ce qui signifie que plusieurs traitements d’un composé donné peuvent être effectués simultanément sans avoir à blesser à nouveau la plante avec plusieurs injections de composés. Sur une note de prudence, l’appareil peut fuir s’il n’est pas installé correctement. En conséquence, le composé est perdu dans l’environnement au lieu d’être livré à l’usine. Par conséquent, il faut prendre soin d’inspecter l’appareil pour tout signe de fuite pendant l’installation et les premiers jours suivants. Bien que le forage d’un trou dans l’arbre soit potentiellement nocif, cette méthode a été choisie pour assurer une absorption robuste et constante du composé. De plus, aucun effet néfaste sur la santé des végétaux n’a été observé à partir de la fixation du dispositif DPI dans ces expériences. Cependant, des plantes supplémentaires devraient être incluses dans la conception expérimentale pour remplacer celles qui peuvent perdre de la vigueur au cours d’une expérience donnée. Enfin, comme ce dispositif utilise un flux passif pour introduire des composés, il peut être difficile de prédire le taux d’absorption entre différentes espèces végétales ou stades de développement de la même espèce. Cela peut compliquer les expériences si la vitesse d’absorption des composés est un facteur limitant. Pour de meilleurs résultats, les expériences doivent être planifiées de manière à ce que la plante dispose de suffisamment de temps pour absorber complètement les 2,5 mL de composé, ce qui peut prendre jusqu’à 1 semaine. En conclusion, ce dispositif DPI est un outil efficace pour l’évaluation rapide de l’activité in planta des composés antimicrobiens ou insecticides contre CLas et son vecteur, D. citri, fournissant ainsi plus d’informations sur l’efficacité systémique et l’influence sur la performance des plantes que le test de feuilles détachées23 présenté précédemment. Sans aucun doute, la variété des applications de ce système va bien au-delà des utilisations spécifiques décrites dans cette étude.

La gestion des plantes dans des environnements commerciaux et paysagers nécessite souvent l’utilisation de composés chimiques pour optimiser la croissance et la santé des plantes. La façon dont ces molécules sont livrées dépend du type de molécule, de la fonction de la molécule, du type de plante et du système de gestion en place. Les applications foliaires et au sol sont les stratégies d’administration les plus faciles, mais les limites de l’absorption de certaines molécules nécessitent une livraison directe. Un exemple de ces molécules est les molécules thérapeutiques qui fonctionnent mieux lorsqu’elles se déplacent systématiquement dans la plante, mais ne peuvent pas être délivrées efficacement par de simples applications topiques1. C’est le cas du Huanglongbing (HLB), également appelé maladie du verdissement des agrumes. Le HLB est une maladie associée à une bactérie limitée en phloème, Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), qui ne peut pas être cultivée en dehors de la plante, ou à son insecte vecteur, Diaphorina citri Kuwayama (D. citri)2.
Si les molécules thérapeutiques présumées sont des produits géniques, elles peuvent être testées en créant des plantes transgéniques exprimant ces composés. Cependant, la production végétale transgénique peut exiger beaucoup de temps et de ressources, dépend fortement du génotype et peut être inhibée par le silençage génique3. De plus, même si ces transgéniques montrent des résultats prometteurs, les contraintes réglementaires et de perception du public réduisent la probabilité de leur acceptation commerciale 4,5. L’application exogène de composés, cependant, simplifie les tests de molécules biologiques et synthétiques car elle ne nécessite pas la production de plantes transgéniques stables ou exprimant transitoirement, ce qui réduit le temps et les ressources pour tester les effets d’une molécule. Une méthode d’administration systémique efficace et efficiente de composés exogènes pourrait être utilisée à des fins de recherche et de criblage.
L’une de ces applications est l’analyse du mouvement systémique des molécules dans le système vasculaire d’une plante, qui peut être effectuée à l’aide de marqueurs traçables, qu’il s’agisse d’isotopes chimiquesfluorescents, visibles ou uniques 6,7,8,9. Un marqueur fluorescent couramment utilisé est le diacétate de 5,6-carboxyfluorescéine (CFDA), qui est un colorant perméable à la membrane qui est dégradé par les estérases intracellulaires en 5,6-carboxyfluorescéine (CF) et, par la suite, devient fluorescent et imperméable à la membrane10. CFDA a été largement utilisé pour surveiller le transport du phloème, les relations entre le puits et la source, et la structuration vasculaire dans les tissus végétaux11,12.
En plus de ces marqueurs, certains composés peuvent modifier directement la physiologie de la plante pour augmenter la productivité ou tuer la plante dans le cas des herbicides. Les insecticides et les composés antimicrobiens sont un moyen d’augmenter la productivité des plantes, en particulier en présence de HLB. Un exemple de molécule antimicrobienne utilisée pour contrôler CLas est la streptomycine. La streptomycine est un antibiotique aminoglycoside qui a été isolé à l’origine de Streptomyces griseus et dont il a été démontré qu’il inhibe la croissance bactérienne par l’inhibition de la biosynthèse des protéines13. En termes d’insecticides, la cible principale de la recherche HLB est D. citri, qui transmet CLas d’arbreà arbre 14. À cette fin, les néonicotinoïdes, tels que l’imidaclopride, sont couramment utilisés, car ils constituent l’étalon-or pour lutter contre les insectes nuisibles15. Toutes ces utilisations variées sont des aspects importants des stratégies actuelles de gestion des plantes, et le développement de nouveaux produits dépend d’essais de criblage efficaces.
Une méthode utilisée pour l’introduction de composés dans les plantes ligneuses est l’injection directe dans le tronc. Divers systèmes ont été conçus et leurs besoins en matière de sites d’injection préforés varient, et ces systèmes utilisent soit l’injection sous pression, soit le débit passif16. Bien que les systèmes basés sur la pression permettent l’introduction rapide d’un composé donné, les dommages physiques potentiels causés par le passage forcé du liquide à travers un système vasculaire bloqué ou embolisé doivent être pris en compte17. Bien que l’application foliaire ou humide des composés prenne moins de temps à mettre en œuvre, l’injection directe de plantes réduit le gaspillage du composé d’intérêt dû aux pertes dans l’air ou le sol et peut également allonger la durée pendant laquelle les composés sont à l’état actif en réduisant l’exposition à l’environnement extérieur18. Ces deux aspects sont importants pour préserver les réactifs coûteux et assurer la cohérence entre les répétitions dans les contextes de recherche.
Cette étude décrit la conception, la construction et l’utilisation d’un dispositif novateur d’infusion directe de plantes (DPI), qui peut être utilisé pour évaluer comment les composés d’intérêt affectent une plante hôte. Une imprimante 3D standard a été utilisée pour fabriquer à la fois l’appareil lui-même et plusieurs composants associés à sa construction. Cette méthode de construction interne permet aux chercheurs de modifier le dispositif et les composants du dispositif en fonction de leurs besoins expérimentaux spécifiques et réduit la dépendance à l’égard des dispositifs d’injection de plantes disponibles dans le commerce. La configuration de l’appareil est simple et efficace, et tous les composants auxiliaires sont facilement disponibles et peu coûteux. Bien que le système ait été conçu pour être utilisé avec une variété d’espèces végétales, les exemples présentés ici concernent les agrumes en pot. De plus, cette étude démontre que ce dispositif est capable de délivrer efficacement plusieurs types de composés par voie systémique aux jeunes plants d’agrumes sans causer de létalité. Les composés testés comprenaient le CFDA, qui a été utilisé pour évaluer la distribution des composés dans la plante, et la streptomycine et l’imidaclopride, qui ont été utilisés pour vérifier que les effets antimicrobiens et insecticides de ces composés ont été observés lorsqu’ils étaient administrés via DPI.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 cm Diameter Steel Balls</td>
			<td>Ballistic Products Inc.</td>
			<td>#SHT #T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>382903029952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G 1 Syringe Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Screw Cap Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1420-9710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/32nd Inch Black Oxide Drill Bit</td>
			<td>Sears</td>
			<td>964077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Printer</td>
			<td>Markforged</td>
			<td>F-PR-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Printing Software</td>
			<td>Markforged</td>
			<td>F-SW-FDVX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Printing Software</td>
			<td>Markforged</td>
			<td>S-FW-OEVX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(6)-CFDA (5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5/64th Inch Black Oxide Drill Bit</td>
			<td>Sears</td>
			<td>964502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well qPCR Machine</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22621408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SP-BX43-BI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>69401-ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloss Clear Spray Paint</td>
			<td>Rustoleum</td>
			<td>249117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grey Lego Baseplate</td>
			<td>Lego</td>
			<td>11024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld Cordless Drill</td>
			<td>Makita</td>
			<td>6349D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidacloprid 2F</td>
			<td>Quali-Pro</td>
			<td>83080133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Plastisol Medium Hardness</td>
			<td>Fusion X Fishing Lures</td>
			<td>XSOL-505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Silicone 70 Shore A O-Ring</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>Varies by Size</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Stick Cooking Spray</td>
			<td>PAM</td>
			<td>64144030217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Plant II</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740770.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>HS234526A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly Viyl Acetate Based Glue</td>
			<td>Elmers</td>
			<td>E301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Master Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A6001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Varies by DNA sequence</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A5003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Razor Blade</td>
			<td>Garvey</td>
			<td>40475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent Silicone RTV Rubber</td>
			<td>Aero Marine Products</td>
			<td>AM 115T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent Silicone Tape</td>
			<td>Maxwell</td>
			<td>KE30S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Truncated Oncocin 112</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Varies by peptide sequence</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White 1 x 6 Lego Piece</td>
			<td>Lego</td>
			<td>300901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Nylon</td>
			<td>Markforged</td>
			<td>F-MF-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct infusion device for molecule delivery in plants

Tester la fonction des composés thérapeutiques chez les plantes est une composante importante de la recherche agricole. Les méthodes foliaires et de trempage du sol sont courantes, mais présentent des inconvénients, notamment une absorption variable et la dégradation environnementale des molécules testées. L’injection de tronc d’arbres est bien établie, mais la plupart des méthodes pour cela nécessitent un équipement coûteux et exclusif. Pour dépister divers traitements pour Huanglongbing, une méthode simple et peu coûteuse pour administrer ces composés dans le tissu vasculaire de petits agrumes cultivés en serre infectés par la bactérie limitée en phloème Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) ou infestés par l’insecte vecteur de phloèmes Diaphorina citri Kuwayama (D. citri) est nécessaire.
Pour répondre à ces exigences de dépistage, un dispositif d’infusion directe de plantes (DPI) a été conçu pour se connecter au tronc de la plante. L’appareil est fabriqué à l’aide d’un système d’impression 3D à base de nylon et de composants auxiliaires faciles à obtenir. L’efficacité de l’absorption du composé de ce dispositif a été testée dans des plants d’agrumes à l’aide du marqueur fluorescent 5,6-carboxyfluorescéine-diacétate. Une distribution uniforme du marqueur dans les plantes a été régulièrement observée.
De plus, ce dispositif a été utilisé pour délivrer des molécules antimicrobiennes et insecticides afin de déterminer leurs effets sur CLas et D. citri respectivement. L’antibiotique aminoglycoside streptomycine a été administré dans des plants d’agrumes infectés par CLas à l’aide du dispositif, ce qui a entraîné une réduction du titre CLas de 2 semaines à 4 semaines après le traitement. L’administration de l’insecticide néonicotinoïde imidaclopride dans les plants d’agrumes infestés par D. citri a entraîné une augmentation significative de la mortalité des psylles après 7 jours. Ces résultats suggèrent que ce dispositif DPI représente un système utile pour délivrer des molécules dans les plantes à des fins de test et de recherche et de criblage.

The management of plants in commercial and landscape settings often requires the use of chemical compounds to optimize the plant growth and health. How these molecules are delivered depends on the type of molecule, the function of the molecule, the type of plant, and the management system in place. Foliar and soil applications are the easiest delivery strategies, but limitations in the uptake of some molecules necessitate direct delivery. An example of these molecules is therapeutic molecules that function best when they move systemically within the plant but cannot be effectively delivered by simple topical applications1. This is the case with Huanglongbing (HLB), also called citrus greening disease. HLB is a disease associated with a phloem-limited bacterium, Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), which cannot be cultured outside of the plant, or its insect vector, Diaphorina citri Kuwayama (D. citri)2.
If the putative therapeutic molecules are gene products, they can be tested by creating transgenic plants expressing these compounds. However, transgenic plant production can be time- and resource-intensive, is highly genotype-dependent, and can be inhibited by gene silencing3. In addition, even if these transgenics show promising results, regulatory and public perception constraints reduce the likelihood of their commercial acceptance4,5. The exogenous application of compounds, however, simplifies the testing of biological and synthetic molecules because it does not require the production of stable or transiently expressing transgenic plants, which reduces the time and resources for testing a molecule&#39;s effects. A method for the effective and efficient systemic plant delivery of exogenous compounds could be used for a wide variety of research and screening purposes.
One of these applications is the analysis of systemic molecule movement within a plant&#39;s vascular system, which can be done using trackable markers, whether they are fluorescent, visible, or unique chemical isotopes6,7,8,9. One commonly used fluorescent marker is 5,6-carboxyfluorescein-diacetate (CFDA), which is a membrane-permeable dye that is degraded by intracellular esterases into 5,6-carboxyfluorescein (CF) and, subsequently, becomes fluorescent and membrane-impermeable10. CFDA has been extensively used to monitor phloem transport, sink and source relationships, and vasculature patterning in plant tissue11,12.
In addition to these markers, certain compounds may directly alter the plant&#39;s physiology to increase the productivity or kill the plant in the case of herbicides. Both insecticides and antimicrobial compounds are a means of increasing plant productivity, especially in the presence of HLB. An example of an antimicrobial molecule that is used to control CLas is streptomycin. Streptomycin is an aminoglycoside antibiotic that was originally isolated from Streptomyces griseus and has been shown to inhibit bacterial growth through the inhibition of protein biosynthesis13. In terms of insecticides, the main target for HLB research is D. citri, which transmits CLas from tree to tree14. For this purpose, neonicotinoids, such as imidacloprid, are commonly utilized, as they are the gold standard for controlling insect pests15. All these varied uses are important aspects of current plant management strategies, and the development of novel products is dependent on efficient screening assays.
One method that is used for the introduction of compounds into woody plants is direct injection into the trunk. A variety of systems have been designed that vary in their needs for predrilled injection sites, and these systems utilize either pressure-based injection or passive flow16. Although pressure-based systems allow for the quick introduction of a given compound, the potential physical damage caused by forcing liquid through blocked or embolized vasculature needs to be considered17. Although the foliar or drench application of compounds is less time-intensive to implement, direct plant injection reduces waste of the compound of interest due to losses to the air or soil and can also lengthen the time that compounds are in an active state by reducing the exposure to the outside environment18. Both these aspects are important for preserving expensive reagents and ensuring consistency among replicates in research settings.
This study describes the design, construction, and use of an innovative direct plant infusion (DPI) device, which can be used to assess how compounds of interest affect a host plant. A standard 3D printer was used to manufacture both the device itself and several components associated with its construction. This in-house construction method allows researchers to modify the device and device components based on their specific experimental needs and reduces the reliance on commercially available plant injection devices. The device setup is simple and efficient, and all the auxiliary components are readily available and inexpensive. Although the system was designed for use with a variety of plant species, the examples presented here pertain to potted citrus plants. Additionally, this study demonstrates that this device is capable of efficiently delivering multiple types of compounds systemically to young citrus plants without causing lethality. The compounds tested included CFDA, which was used to assess the compound distribution in the plant, and streptomycin and imidacloprid, which were used to verify that the antimicrobial and insecticidal effects of these compounds were observed when delivered via DPI.

Pleins feux sur l’auteur : Dispositif de perfusion directe pour l’administration de molécules dans les plantes  

DISPOSITIF DE PERFUSION DIRECTE POUR ADMINISTRATION DE MOLÉCULES DANS LES PLANTES

Delivering a therapeutic molecule to where a pathogen resides in a plant can be challenging. Treating Candidatus Liberibacter asiaticus, or CLas, a bacteria that is limited to the phloem, poses one of the biggest challenges in delivering molecules against it, especially when using conventional methods such as spray applications. The ease of printing the direct plant infusion device and its simple implementation makes it accessible to anyone.This enables the widespread screening of molecules for their potential therapeutic effect in trees. An added benefit is that the diffusion of molecules utilizes the natural process of plant transpiration. Our research improved efficiency and precision of molecular delivery in plants, which can be used for a range of research applications.By screening hundreds of molecules on small plants, we can eliminate the need for larger trees, leading to a reduction in cost and space utilization.

Watch this Scientific Journal Video about Direct Infusion Device for Molecule Delivery in Plants at JoVE.com

Ce manuscrit décrit un nouveau dispositif d’infusion directe de plantes pour cribler l’efficacité de molécules contre la bactérie (Candidatus Liberibacter asiaticus) ou son insecte vecteur (Diaphorina citri, Kuwayama) qui, en combinaison, sont associées à la maladie des agrumes de Huanglongbing.

Testing the function of therapeutic compounds in plants is an important component of agricultural research. Foliar and soil-drench methods are routine but ...

L’administration d’une molécule thérapeutique à l’endroit où réside un agent pathogène dans une plante peut être difficile. Le traitement de Candidatus Liberibacter asiaticus, ou CLas, une bactérie limitée au phloème, pose l’un des plus grands défis pour délivrer des molécules contre lui, en particulier lors de l’utilisation de méthodes conventionnelles telles que les applications par pulvérisation. La facilité d’impression du dispositif d’infusion directe de plantes et sa mise en œuvre simple le rendent accessible à tous.Cela permet le criblage généralisé des molécules pour leur effet thérapeutique potentiel dans les arbres. Un avantage supplémentaire est que la diffusion des molécules utilise le processus naturel de transpiration des plantes. Nos recherches ont amélioré l’efficacité et la précision de l’administration moléculaire dans les plantes, qui peuvent être utilisées pour une gamme d’applications de recherche.En criblant des centaines de molécules sur de petites plantes, nous pouvons éliminer le besoin d’arbres plus grands, ce qui entraîne une réduction des coûts et de l’utilisation de l’espace.

direct-infusion-device-for-molecule-delivery-in-plants

Research

JoVE Journal

Biology

Direct Infusion Device for Molecule Delivery in Plants

1.3K vues.  United States Department of Agriculture Agricultural Research Service U.S. Horticultural Research Laboratory. L’administration d’une molécule thérapeutique à l’endroit où réside un agent pathogène dans une plante peut être difficile. Le traitement de Candidatus Liberibacter asiaticus, ou CLas, une bactérie limitée au phloème, pose l’un des plus grands défis pour délivrer des molécules contre lui, en particulier lors de l’utilisation de méthodes conventionnelles telles que les applications par pulvérisation. La facilité d’impression du dispositif d’infusion directe de pla...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Dispositif de perfusion directe pour l’administration de molécules dans les plantes  

Testing the function of therapeutic compounds in plants is an important component of agricultural research. Foliar and soil-drench methods are routine but have drawbacks, including variable uptake and the environmental breakdown of tested molecules. Trunk injection of trees is well-established, but most methods for this require expensive, proprietary equipment. To screen various treatments for Huanglongbing, a simple, low-cost method to deliver these compounds to the vascular tissue of small greenhouse-grown citrus trees infected with the phloem-limited bacterium Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) or infested with the phloem-feeding CLas insect vector Diaphorina citri Kuwayama (D. citri) is needed.
To meet these screening requirements, a direct plant infusion (DPI) device was designed that connects to the plant&#39;s trunk. The device is made using a nylon-based 3D-printing system and easily obtainable auxiliary components. The compound uptake efficacy of this device was tested in citrus plants using the fluorescent marker 5,6-carboxyfluorescein-diacetate. Uniform compound distribution of the marker throughout the plants was routinely observed.
Furthermore, this device was used to deliver antimicrobial and insecticidal molecules to determine their effects on CLas and D. citri respectively. The aminoglycoside antibiotic streptomycin was delivered into CLas-infected citrus plants using the device, which resulted in a reduction in the CLas titer from 2 weeks to 4 weeks post treatment. Delivering the neonicotinoid insecticide imidacloprid into D. citri-infested citrus plants resulted in a significant increase in psyllid mortality after 7 days. These results suggest that this DPI device represents a useful system for delivering molecules into plants for&#160;testing and facilitate research and screening purposes.

This manuscript describes a novel direct plant infusion device for screening the effectiveness of molecules against the bacteria (Candidatus Liberibacter asiaticus) or its insect vector (Diaphorina citri, Kuwayama) that, in combination, are associated with Huanglongbing citrus disease.

Recherche

Biologie

﻿3D-Printing of Direct Plant Infusion (DPI) Device and Fabrication of Plastisol Rings

3D-Printing of Direct Plant Infusion (DPI) Device and Fabrication of Plastisol Rings  

To begin 3D printing the direct plant infusion or DPI device and mold components, apply a thin layer of polyvinyl acetate-based glue on the print bed of the printer. Load nylon filament into the printer and prepare the printer per the manufacturer's instructions. After importing the desired STL files, set up the printer and start printing.Once the piece is removed from the print bed after printing, rinse the polyvinyl acetate-based glue from the base of the printed component with water. Spray the printed DPI device and other components with two coats of clear gloss spray paint. To fabricate the plastisol ring mold, assemble a mold form by building a rectangular enclosure using snap-together plastic blocks on a base.It should be large enough to hold the pattern pieces. Mix the room temperature vulcanizing silicone or RTV silicone monomer and the catalyst together at a 10:1 ratio by stirring for one minute. Color the solution by adding three drops of food coloring and one milliliter of hand soap per 25 milliliters of silicone mixture.Then, pour a thin layer of the silicone solution into the mold form sufficiently to fully cover the bottom of the mold form. Tamp to flatten the surface of the poured silicone, and wait for 24 hours to set the silicone. Once the silicone is set, pour another layer of silicone deep enough to cover the center hole core print of the pattern.Insert the pattern into the liquid silicone with the center hole core print facing down. Ensure that no bubbles are trapped and the patterns are well separated and not touching each other. Secure the patterns with either a heavy object or tape to prevent them from floating out of the silicone while it sets.Once set, pour additional layers of silicone into the mold form until the level is flush with the top of the pattern. Let the silicone cure for 24 hours. Disassemble the snap-together plastic blocks to release the mold.Then, remove the patterns from the mold and inspect the mold for tears or deformities. For casting the plastisol rings, coat the interior of the mold, all the core components, and the O-rings with cooking oil. Place an O-ring around the notch in the middle of the center post core, and place the core in the center hole of the plastisol ring mold.Insert the delivery channel core into the space on the side of the plastisol ring mold. Orient the V-shaped tip at the end of the delivery channel core to align with the O-ring on the center post core. Next, heat plastisol in the microwave for short bursts of 10 seconds till the solution reaches 160 to 170 degrees Celsius.In between, stir the plastisol gently to avoid bubbles. Pour the molten plastisol into the plastisol ring mold near the outside edge of the mold without introducing bubbles. Wait one hour for the plastisol rings to cool.Then, remove the rings from the mold. The DPI device was eight centimeters in height and three centimeters in width. It had a single central reservoir contiguous with the spout.The total volume that can be contained within these components is 2.0 milliliters. The 1.8 centimeter tall and 2.7 centimeter wide plastisol ring also contained two channels. One to accommodate the DPI device spout and another of variable diameter for fitting around the trunk of the tree.When assembled properly, the plastisol ring should be flush against the DPI device and the spout should line up with the hole drilled in the tree.

Impression 3D d’un dispositif d’infusion directe de plantes (DPI) et fabrication d’anneaux de plastisol

Attachment of the Direct Plant Infusion (DPI) Device to Citrus Plants for Compound Injection

Propagate small potted citrus trees from rooted vegetative cuttings or seeds. Grow the potted citrus lines at 28 degrees Celsius, maintaining a proper day length. Select citrus plants of the appropriate size for the experiment.To attach the 3D-printed Direct Plant Infusion or DPI device to the trunk of the plant, find a smooth, healthy site on the trunk without bumps or knots. Using a two-millimeter-diameter drill bit, horizontally drill a hole through the center of the stem at an angle of 90 degrees to the trunk surface. Run the drill bit through the hole several times to create an unobstructed, smooth hole.Then create a vertical slice in the plastisol ring on the opposite side of the compound delivery channel. Fit the ring around the plant, aligning the delivery channel with the previously-drilled hole. Attach the DPI device to the plastisol ring, ensuring they fit snugly together, and align the DPI device spout with the plastisol ring delivery channel and the drilled hole.Wrap it tightly with silicone tape to hold the apparatus in place. Inspect the fully assembled and attached device to ensure proper alignment and orientation. The groove around the vertical channel allowed additional compound uptake through the bark.When assembled properly, the plastisol ring flushed against the DPI device and the spout lined up with a hole drilled in the tree.

Fixation du dispositif d’infusion directe de plantes (DPI) à des plants d’agrumes pour injection de composés

Applying Compounds to Citrus Plants Using a Novel 3D-Printed Direct Plant Infusion (DPI) Device

To apply compounds to the plants using the Novel 3D-Printed Direct Plant Infusion, or DPI device, ensure the device is properly fitted to the plants. When assembled properly, the plastisol ring should be flush against the DPI device and the spout should line up with the hole drilled in the tree. Use a syringe or pipette to fill the DPI device with the compound solution of interest.Using a syringe, penetrate the silicone tape and plastisol ring opposite to the DPI device to extract air from the interior channel. Replace any extracted compound back into the DPI device. Add an additional small patch of silicone tape over the hole created by the syringe to reinforce the area and prevent tears.Inspect the apparatus for visible leakages at the attachment point and inspect the device reservoir for a stable liquid level. Cover the open end of the DPI device with a wax sealing film and pull it down to form a seal to reduce the evaporation of the experimental compound. Poke a single a hole in the wax film with a syringe tip to prevent the development of a vacuum, and subsequently refill the device.Check the apparatus daily to ensure proper alignment of the components, and top off the liquid using a syringe to avoid the reservoir running dry til the desired amount is delivered. When two milliliters of two millimolar CFDA dye was introduced to the plant using the DPI device, a fluorescent signal was detected in the vasculature of the treated plant, but was absent in the controlled plant treated with 20%DMSO in water. This signal was observed within 24 hours of treatment, evenly throughout the dissected plant tissue types.Treatment of streptomycin on Candidatus Liberibacter Asiaticus or CLass positive plants showed a reduction in the mean bacterial titer to 28 days after treatment compared to the control. The treated plants showed a lower mean CLas titer over all combined time points. The streptomycin treated plants as compared to the controls showed an occasional increase in new healthy flush growth after 60 days.Imidacloprid treatment on plants significantly reduced nymph emergence at the highest Imidacloprid concentration compared to the corresponding egg count. This was visually apparent in the reduction in nymph honeydew production.