Nous remercions R. Sun et d&#39;autres étudiants du Laboratoire de Chen pour leur contribution à planter génération de matériel. Nous remercions également le Dr D. Green pour son soutien à la recherche de premier cycle au Collège de technologie et l&#39;innovation (CTI). Cette recherche a été financée en partie par des subventions du NIH U01 AI075549 et 1R21AI101329 à Q. Chen, et une subvention SSE de CTI de l&#39;Arizona State University à Q. Chen. K. Leuzinger, M. Dent, J. Hurtado, et J. Stahnke sont des étudiants pris en charge par la subvention SSE.

1. Croissance des végétaux <ol><li> Lieu 60 pastilles de tourbe dans un bac de propagation. Ajouter 4 L d&#39;eau du robinet et laisser les pastilles de tourbe absorber l&#39;eau pendant 2 heures. </li><li> Ajouter 2 N. benthamiana graines dans chaque tourbe granulés à l&#39;aide d&#39;un semoir, couvrent le plateau avec un dôme en plastique transparent, et leur permettre de germer dans une ° C, l&#39;environnement d&#39;humidité de 25 à 84% avec un cycle jour / nuit 16/8 h (figure 1A). </li><li> Retirez le dôme deux semaines après le semis, drainer l&#39;eau du bac, et ajouter 2 litres d&#39;engrais de Jack à une concentration de 1,48 g / L (figure 1B). Continuer à pousser des plantes dans une ° C, l&#39;environnement d&#39;humidité de 25 à 50% avec un HR jour / cycle de nuit 16/8. Fournir 2 L de l&#39;engrais Jack de tous les 2 jours par plateau. </li><li> A la semaine 4, transférer les plantes avec pastilles de tourbe à un nouveau plateau qui héberge six usines de fournir suffisamment d&#39;espace pour davantage de croissance (figure 1C) jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient prêts à être infiltré à 6 semaines d&#39;âge (figure1D). </li></ol> 2. A. tumefaciens Culture Préparation 2.1 Préparation pour l&#39;infiltration de la seringue <ol><li> Série A. GV3101 souches tumefaciens contenant les vecteurs geminiviral p19, pREP110, pBYGFP et pBYDsRed sur des plaques d&#39;agar LB contenant de la kanamycine (100 pg / ml). Morts à une souche par plaque et croître à 30 ° C pendant 48 heures. </li><li> De même, série et grandir GV3101 souches portant les vecteurs de MagnICON de l&#39;extrémité 5 &#39;module (pICH15879), 3&#39; module contenant le gène cible de la GFP ou DsRed (Pich-GFP ou Pich-DsRed) et intégrase (pCH14011) sur gélose LB des plaques contenant de la carbénicilline (100 ug / ml). </li><li> À partir d&#39;une seule colonie sur la plaque de gélose LB, inoculer GV3101 souches portant vecteurs geminiviral dans 3 ml de milieu YENB (0,75% d&#39;extrait de levure Bacto, 0,8% de bouillon de nutriments, ajuster le pH à 7,5 avec NaOH) + kanamycine (100 pg / ml) dans un tube de culture à fond rond de 15 ml, grandir la culture liquide à 30 ° C dansun agitateur pendant une nuit avec une vitesse de rotation de 300 tours par minute. </li><li> De même, ensemencer et cultiver GV3101 souches portant les vecteurs de MagnICON dans YENB médias + carbénicilline (100 ug / ml) dans un shaker pendant la nuit à 30 ° C. </li><li> Mesurer et enregistrer DO 600 valeurs pour chaque culture liquide avec un spectrophotomètre et utiliser la formule suivante pour calculer le volume nécessaire (V sub) pour être repiquées pour une nouvelle culture avec un OD à partir de 0,025 600 dans 10 ml de milieu YENB avec des antibiotiques appropriés . V sub (ml) = (10 ml) x (0,025) / OD 600 </li><li> Transfert V sub (ml) de la culture de la nuit à (10 - V sub) ml de milieu YENB avec des antibiotiques appropriés pour chaque souche. Cultiver la nouvelle culture d&#39;une nuit à 30 ° C dans un agitateur avec une vitesse de rotation de 250 tours par minute jusqu&#39;à ce que de la valeur de DO 600 est dans la gamme de 1,7 à 2,0. </li><li> Mesurer et enregistrer OD 600 valeurs pour chaque culture liquide et utiliser la formule ci-dessous pour calculer le volume nécessaire (V inf) doit être dilué dans 50 ml de tampon d&#39;infiltration de donner une DO finale 600 de 0,12 pour chaque souche. V inf (ml) = (50 ml) x (0,12) / OD 600 </li><li> Transfert V inf (ml) de chaque culture dans un tube à centrifuger et centrifuger les cellules par centrifugation à 12000 g pendant 2 min, retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un tampon d&#39;infiltration de 10 ml (10 mM MES, pH 5,5, 10 mM MgSO 4) au vortex brièvement. </li><li> Mélanger les cellules de pBYGFP + pREP110 + p19 remis en suspension, tourner les cellules vers le bas à 12.000 g pendant 2 min, et remettre au total de 50 ml de tampon d&#39;infiltration. Cette combinaison Agrobacteria est l&#39;expression de la GFP geminiviral. </li><li> De même, mélanger les combinaisons suivantes de cellules agrobactéries, ralentit et les remettre en suspension dans 50 ml de tampon d&#39;infiltration. Ils incluent (1) pBYDsRed + pREP110 + p19 d&#39;expression geminiviral de DsRed, (2) pBYGFP + + pBYDsRed pREP110+ P19 pour geminiviral co-expression de la GFP et DsRed, (3) pREp110 + p19 comme contrôle négatif de l&#39;expression geminiviral, (4) Pich-GFP + + pICH15879 pCH14011 d&#39;expression MagnICON de la GFP, (5) Pich-DsRed + pICH15879 + pCH14011 pour l&#39;expression de MagnICON DsRed, et (6) pICH15879 + pCH14011 comme témoin négatif pour l&#39;expression d&#39;MagnICON. </li></ol> 2.2 Préparation pour une infiltration sous vide <ol><li> Inoculate et la culture de chaque souche GV3101 contenant des vecteurs geminiviral ou vecteurs de MagnICON dans 15 ml de milieu YENB avec des antibiotiques appropriés dans un flacon stérilisé à l&#39;autoclave de 50 ml et de croître pendant la nuit comme décrit pour seringue infiltration ci-dessus. </li><li> Mesurer et enregistrer DO 600 valeurs pour chaque culture liquide avec un spectrophotomètre et utiliser la formule suivante pour calculer le volume nécessaire (V sub) pour être repiquées pour une nouvelle culture avec un départ OD 600 de 0.025 dans 250 ml de milieu YENB avec des antibiotiques appropriés . V sous </sub&gt; (Ml) = (250 ml) x (0,025) / OD 600 </li><li> Transfert V sub (ml) de la culture de la nuit à (250 - V sub) ml de milieu YENB dans un ballon de 1 autoclave avec des antibiotiques appropriés pour chaque souche et croître la nouvelle culture de la nuit tel que décrit à l&#39;infiltration de la seringue au-dessus. </li><li> Mesurer et enregistrer OD 600 valeurs pour chaque culture liquide et utiliser la formule suivante pour calculer le volume nécessaire (V inf) à diluer dans 3 L de tampon d&#39;infiltration de donner une DO finale 600 de 0,12 pour chaque souche. V inf (ml) = (3000 ml) x (0,12) / OD 600 </li><li> Pellet et remettre en suspension inf V (ml) de chaque culture dans le tampon d&#39;infiltration tel que décrit à l&#39;infiltration de la seringue et mélanger les cultures remises en suspension en fonction des combinaisons mentionnées à l&#39;infiltration de la seringue. Repellet les cellules agrobactéries mixtes et les remettre en suspension dans 3 L de tampon d&#39;infiltration. </li></ol> 3.1 Seringue Infiltration <ol><li> Choisissez quatre âgées de 6 semaines N. benthamiana avec 5 feuilles chacun. Les trois premières feuilles de comptage à partir de la partie supérieure de chaque plante sont infiltrés entièrement à l&#39;une des combinaisons de A. tumefaciens souches dans le tampon d&#39;infiltration. La quatrième feuille sera ponctuelle infiltré avec toutes les combinaisons de contrainte quatre pour l&#39;expression geminiviral ou trois combinaisons pour l&#39;expression MagnICON. La dernière feuille de chaque plante sera infiltrée par des combinaisons de contrôles négatifs. </li><li> Créer une petite entaille avec une aiguille dans l&#39;épiderme de la face arrière de la feuille (figure 2A). Attention: veillez à ne pas rayer si difficile à percer la feuille par les deux parties, comme les cellules agrobactéries dans le mélange d&#39;infiltration vont passer à travers la ponction de l&#39;autre côté de la feuille. </li><li> Prendre une prise ferme de la face avant de la feuille et en appliquant doucecontre-pression à l&#39;entaille avec le pouce d&#39;une main, injecter des mélanges d&#39;Agrobacterium dans le tampon d&#39;infiltration dans le nick avec une seringue sans aiguille (figure 2B). Remarque: Comme le mélange Agrobacterium pénètre dans l&#39;espace intercellulaire de la feuille, la zone d&#39;infiltration devient vert visiblement plus sombre (figure 2C). </li><li> Continuer à injecter des mélanges d&#39;Agrobacterium dans le nick jusqu&#39;à ce que le cercle vert foncé cesse de se développer. Créer un autre nick et répétez les étapes 3.1.2-3.1.4 jusqu&#39;à la feuille entière est infiltrée et la feuille entière devient vert foncé pour les trois premières feuilles et la dernière feuille. </li><li> Pour la quatrième feuille de chaque plante, toutes les combinaisons de quatre (vecteur geminiviral) ou trois (MagnICON vecteur) seront infiltrés dedans. Faire une entaille pour chaque combinaison de souches d&#39;Agrobacterium, et infiltrer chaque entaille avec une combinaison. </li><li> Après infiltration, déplacer des plantes à la salle de la croissance et Moniexpression de protéine TOR entre 2-15 jours après l&#39;infiltration (dpi). </li></ol> 3.2 Infiltration vide <ol><li> Placer un bac dans un dessiccateur à vide et un tampon d&#39;infiltration de L 3 de transfert contenant les souches d&#39;Agrobacterium à la baignoire. Raccorder le dessiccateur à une pompe à vide à membrane Vacuubrand (figure 3A). </li><li> Placer une plante à l&#39;envers sur la plaque de dessiccateur (figure 3B) et abaisser la plaque avec la plante jusqu&#39;à ce que toute la feuille et le système de tige est immergée dans le tampon d&#39;infiltration avec la plaque de repos au sommet de la cuve. Placez l&#39;anneau de dessiccateur O le long de la jante et mettre le couvercle de dessiccateur sur la chambre (figure 3C). </li><li> Mettre la pompe à vide et commencer à chronométrer quand le vide atteint 100 mbar. Ouvrez lentement la vanne de sortie sur le dessiccateur après 1 min à 100 mbar pour permettre l&#39;entrée de Agrobacteria dans les espaces interstitiels des tissus de la plante submergée. Répétez cette étape une additional temps pour assurer une bonne infiltration. </li><li> Après infiltration, prenez la plante sur le dessiccateur et le remettre dans sa position verticale. Déplacez plantes à la salle de la croissance et de l&#39;expression de la protéine de contrôle entre 2-15 dpi. </li></ol> 4. Détection de la protéine fluorescente et Photographie <ol><li> A partir de 2 dpi, déplacer des plantes dans une pièce sombre et faire briller la lumière UV sur la face arrière des feuilles infiltrées avec une lampe UV à main. </li><li> Respecter la fluorescence verte de la GFP ou la fluorescence rouge de DsRed. GFP émet un signal plus fort avec de la lumière UV à ondes longues, tandis que DsRed est plus forte sous la lumière UV à ondes courtes. </li><li> Prenez des photos de feuilles fluorescentes avec un appareil photo numérique ordinaire sans flash. </li><li> Déplacez plantes à la salle de la croissance après l&#39;observation ou la photographie. </li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont aucun conflit d&#39;intérêts financiers.

La demande croissante de produits pharmaceutiques à base de protéines dans le monde entier exigent de nouvelles plates-formes de production qui sont robustes, évolutives et à faible coût et en toute sécurité. Les plantes ont montré pour être l&#39;un des systèmes de production alternatifs les plus prometteurs pour la production de protéines pharmaceutiques. Au cours des dernières années, le développement de déconstruits vecteurs à base de virus a permis l&#39;expression transitoire de protéines dans les...

Depuis les années 1970, les plantes ont été étudiées comme des alternatives aux cultures de cellules de mammifères, d&#39;insectes et des bactéries pour la production commerciale de protéines recombinantes et des protéines thérapeutiques 1. Les systèmes à base de plantes pour l&#39;expression de produits biopharmaceutiques ont montré des résultats prometteurs au cours des dernières années, plusieurs nouveaux traitements pour les maladies, comme la maladie de Gaucher 2, et la grippe aviaire H5N1 3, ont connu le succès dans les essais cliniques. Le développement des mécanismes compétents pour l&#39;expression de protéines recombinantes dans les plantes dans les décennies qui ont suivi ces premières expériences a créé le potentiel pour les systèmes à base de plantes pour modifier le paradigme actuel de la production de protéines pour trois raisons principales. Tout d&#39;abord, il ya une diminution notable des coûts de bioréacteurs de mammifères, d&#39;insectes et bactéries nécessitent des dépenses considérables de démarrage, les médias de croissance coûteux, et les processus complexes de purification en aval 4. La création de plante transgénique stablelignes leur permet aussi de dépasser l&#39;évolutivité d&#39;autres systèmes d&#39;expression que les plantes exprimant des protéines pourraient être cultivées et récoltées à l&#39;échelle agricole 5. Deuxièmement, les systèmes d&#39;expression à base de plantes réduisent considérablement le risque de transmission d&#39;un agent pathogène humain ou d&#39;un animal à partir de l&#39;hôte protéines exprimant à l&#39;homme, ce qui démontre la supériorité de la sécurité publique 6. Enfin, les plantes utilisent un système endomembranaire eucaryote qui est semblable à des cellules de mammifères, ce qui permet à la bonne modification post-traductionnelle de protéines comprenant la glycosylation et l&#39;assemblage des protéines à sous-unités multiples 7. Cette capacité met systèmes à base de plantes en avance sur ceux basés sur des systèmes procaryotes, comme les bactéries, car un plus grand nombre de protéines recombinantes pharmaceutiques, y compris les anticorps monoclonaux (Acm), ont une structure plus complexe et nécessiterait d&#39;importantes modifications post-traductionnelles ou assemblage 8. Il existe deux grands appromaux à l&#39;expression de protéines recombinantes dans les plantes. Le premier est le développement d&#39;une lignée transgénique stable, où l&#39;ADN codant pour la protéine cible est clonée dans une cassette d&#39;expression et introduit soit à des génomes nucléaires ou chloroplastiques. Pour ce faire, l&#39;ADN étranger devient héréditaire à travers les générations et permet de considérablement amélioré l&#39;évolutivité, bien au-delà que d&#39;autres systèmes d&#39;expression 1. Introduction d&#39;ADN exogène dans le génome nucléaire est habituellement obtenue par Agrobacterium tumefaciens infection des tissus de la plante ou, plus rarement, par bombardement de microprojectiles du tissu 9. Les hormones végétales sont ensuite utilisés pour induire la différenciation et de la croissance du tissu de plante transgénique tel que les racines et les feuilles. La transformation du génome chloroplastique ne peut pas être obtenue avec A. tumefaciens, mais repose entièrement sur ​​des particules d&#39;or ou de tungstène recouvertes d&#39;ADN tiré balistique dans des cellules végétales. La seconde méthode d&#39;exprimer recombinaisonnt protéines dans les plantes est à travers l&#39;expression transitoire 10. Dans ce scénario, les vecteurs dérivés de virus hébergeant le gène d&#39;intérêt sont livrés via A. tumefaciens aux plantes entièrement développées par un processus appelé agroinfiltration. Au lieu d&#39;intégrer dans le génome de la plante, la construction du gène livré va alors commencer à diriger la production transitoire de la protéine désirée, qui peut être récoltée et isolé après une courte période d&#39;incubation. Expression transitoire de gènes offre l&#39;avantage d&#39;une plus grande accumulation de la protéine globale ainsi qu&#39;une amélioration du temps de production de protéines, comme les plantes seront prêts à récolter environ 1-2 semaines après agroinfiltration 11. Ce chiffre est nettement plus rapide que les procédés de production, la sélection et la confirmation de lignées de plantes transgéniques stables, ce qui peut prendre plusieurs mois à un an. Cependant, c&#39;est aussi la limitation du système d&#39;expression transitoire, car il ne cédera pas génétiquement stable plante lines qui peuvent être utilisés pour générer une banque de semences pour la production commerciale à grande échelle. Malgré cela, des approches ont été développées pour améliorer l&#39;expression transitoire à grande échelle. Ici, nous démontrons une méthode de génération de protéines exprimant transitoires Nicotiana benthamiana utilisant des vecteurs viraux déconstruits livrés par A. tumefaciens. Deux grandes méthodes sont en cours d&#39;élaboration pour la livraison de A. tumefaciens dans les tissus de la plante: l&#39;infiltration de l&#39;échelle du laboratoire via une seringue et d&#39;infiltration à grande échelle via la chambre à vide. Les deux protocoles sont décrits ici en utilisant N. benthamiana, qui est étroitement liée à la plante de tabac commun, comme la plante hôte pour l&#39;expression transitoire de deux protéines fluorescentes: la protéine fluorescente verte (GFP) de méduse Aequorea victoria et la protéine fluorescente rouge de Discosoma corail (DsRed) 12,13. N. benthamiana est la plante hôte la plus courante pourprotéine recombinante, car il se prête à la transformation génétique, peut produire de grandes quantités de biomasse rapidement, et est un producteur prolifique de semences pour la production à grande échelle jusqu&#39;à 14. Un autre avantage de l&#39;utilisation de N. benthamiana comme hôtes pour l&#39;expression des protéines est la disponibilité d&#39;une variété de vecteurs d&#39;expression 2,5. Dans cette étude, deux vecteurs viraux déconstruits, l&#39;un basé sur un ARN système réplicon (vecteurs MagnICON) et l&#39;autre dérivé du système réplicon ADN (vecteurs geminiviral) 4,11 virus du nanisme jaune de haricot (BeYDV), le virus de la mosaïque du tabac (TMV) 15-18, sont utilisés pour transporter le gène GFP et DsRed et de les livrer dans N. cellules benthamiana Via A. tumefaciens Trois constructions d&#39;ADN. seront utilisés pour la GFP ou expression DsRed avec des vecteurs d&#39;MagnICON. Ils comprennent en 5 &#39;module (pICH15879) contenant le promoteur et d&#39;autres éléments génétiques pour entraîner l&#39;expression du gène cible, l&#39;extrémité 3&#39; module contenant le gène d&#39;intérêt (PICH-GFP-PICH ou DsRed), et le module de l&#39;intégrase (pICH14011) codant pour une enzyme qui intègre les extrémités 5 &#39;et 3&#39; modules ensemble lors de l&#39;expression 8,15. Trois constructions d&#39;ADN sont également nécessaires pour l&#39;expression des vecteurs geminiviral. En plus de vecteurs contenant le réplicon du gène cible (pBYGFP ou pBYDsRed), un vecteur codant pour la protéine de réplication (pREP110) est requise pour l&#39;amplification de la cible réplicon 11,14,16. En outre, l&#39;inclusion d&#39;un vecteur codant pour la p19 suppresseur de silence à partir de virus de rabougrissement de la tomate est souhaitée pour l&#39;expression d&#39;un gène cible de haut niveau 11,16. Il ya généralement trois grandes étapes pour l&#39;introduction de gènes de protéines recombinantes dans des cellules végétales par agroinfiltration y compris la croissance des plantes, A. préparation culture tumefaciens, et l&#39;infiltration. Comme chaque étape est cruciale pour le succès final de cette procédure, par conséquent, une description détaillée de chaque est fournià la fois pour l&#39;infiltration de la seringue et l&#39;infiltration sous vide en dessous.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GFP </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V353-20</td>
			<td><a href="http://www.invitrogen.com/" target="_blank">www.invitrogen.com</a> See reference: Lico and Chen, et al 2008</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DsRed</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632152</td>
			<td><a href="http://www.clontech.com/" target="_blank">www.clontech.com</a> See reference: Baird and Zacharias, et al 2000</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MagnICON Vector</td>
			<td>Icon Genetics</td>
			<td>n/a</td>
			<td><a href="http://www.icongenetics.com/" target="_blank">www.icongenetics.com</a> See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Geminiviral Vector</td>
			<td>Author's Lab</td>
			<td>n/a</td>
			<td>See reference: Chen and He, et al 2011</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>N. benthamiana</td>
			<td>Author's Lab</td>
			<td>n/a</td>
			<td><a href="http://www.herbalistics.com.au" target="_blank">herbalistics.com.au</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Agrobacterium tumefaciens strain gv3101</td>
			<td>Author's Lab</td>
			<td>n/a</td>
			<td>See reference: Lai and Chen 2012</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LB Agar Carbenicillin-100, plates</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0418</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LB Agar Kanamycin-50, plates</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0543</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Magnesium sulfate hepa hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2773-500 g</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bacto-Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>73049-73-7</td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bacto Yeast Extract</td>
			<td>Becton, Dickinson &amp; CO.</td>
			<td>REF 212750</td>
			<td><a href="http://www.bd.com/" target="_blank">www.bd.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Difco Nutrient Broth</td>
			<td>Becton, Dickinson &amp; CO.</td>
			<td>REF 234000</td>
			<td><a href="http://www.bd.com/" target="_blank">www.bd.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MES hydrate Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250-1kg</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1613-1ML</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70560-51-9</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221465</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Jack's Fertilizer</td>
			<td>Hummert International</td>
			<td>Jul-25</td>
			<td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Vacuubrand MD4 Vacuum Pump</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-878-113</td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Vacuum Air Regulator Valve</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9386590</td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Desiccator 12 1/8" with O ring</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-594-15C </td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>3 L Tub</td>
			<td>Rubber-Maid</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Rubbermaid Servn' Saver Bowl, 10-cup will work</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>plate/shelf 230ML</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9489269</td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Peat Pellet</td>
			<td>Hummert International</td>
			<td>14-2370-1</td>
			<td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Propagation Tray Dome</td>
			<td>hydrofarm</td>
			<td>132052</td>
			<td><a href="http://www.hydroponics.net/" target="_blank">www.hydroponics.net</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Propagaiton Tray</td>
			<td>hydrofarm</td>
			<td>138758</td>
			<td><a href="http://www.hydroponics.net/" target="_blank">www.hydroponics.net</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Virbo Hand Seeder</td>
			<td>Gro-Mor INC</td>
			<td>n/a</td>
			<td><a href="http://www.gro-morent.com/" target="_blank">www.gro-morent.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Flora Cart 4 shelf</td>
			<td>Hummert International</td>
			<td>65-6924-1</td>
			<td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>15 ml Round Bottom Culture Tubes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS430172-500EA</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">http://www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spectrophotometer Cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>223-9950</td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1415-2500</td>
			<td><a href="http://www.usascientific.com/" target="_blank">www.usascientific.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>166-0602EDU</td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Incubator/Shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Excella E25</td>
			<td><a href="http://www.eppendorf.com/" target="_blank">www.eppendorf.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ultraviolet Light Model#: UVGL-25</td>
			<td>UVP</td>
			<td>95-0021-12</td>
			<td><a href="http://www.uvp.com/" target="_blank">www.uvp.com</a></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

efficient agroinfiltration of plants for high-level transient expression of recombinant proteins

Culture de cellules de mammifères est la plate-forme importante pour la production commerciale de vaccins humains et protéines thérapeutiques. Toutefois, il ne peut pas répondre à la demande mondiale croissante pour les produits pharmaceutiques en raison de son évolutivité limitée et coût élevé. Les plantes ont montré pour être l&#39;une des plateformes les plus prometteuses alternatives de production pharmaceutiques qui sont robustes, évolutives et à faible coût et en toute sécurité. Le développement récent de vecteurs à base de virus a permis l&#39;expression transitoire rapide et à haut niveau de protéines recombinantes dans les plantes. Pour optimiser davantage l&#39;utilité du système d&#39;expression transitoire, nous démontrons une méthode simple, efficace et évolutive pour introduire du gène cible contenant Agrobacterium dans un tissu végétal dans cette étude. Nos résultats indiquent que agroinfiltration à la fois avec une seringue vide et méthodes ont abouti à la mise en place efficace d&#39;Agrobacterium dans des feuilles et de la production robuste de deux protéines fluorescentes, GFP et DsRed. Par ailleurs,nous démontrons les avantages uniques offerts par les deux méthodes. infiltration de la seringue est simple et ne nécessite pas de matériel coûteux. Il permet également la souplesse voulue pour infiltrer la durée du congé avec un gène cible, ou d&#39;introduire des gènes cibles multiples sur une feuille. Ainsi, il peut être utilisé pour l&#39;expression de l&#39;échelle du laboratoire de protéines recombinantes ainsi que pour comparer différentes protéines ou des vecteurs de rendement ou d&#39;expression cinétique. La simplicité de l&#39;infiltration de la seringue suggère également son utilité dans l&#39;enseignement secondaire et collégial pour le sujet de la biotechnologie. En revanche, l&#39;infiltration sous vide est plus robuste et peut être adapté en place pour la production commerciale de protéines pharmaceutiques. Il offre également l&#39;avantage d&#39;être en mesure de agroinfiltrate espèces végétales qui ne se prêtent pas à l&#39;infiltration de la seringue comme la laitue et Arabidopsis. Dans l&#39;ensemble, la combinaison de la seringue et agroinfiltration à vide offre aux chercheurs et éducateurs un moyen simple, efficace et robusteméthodologie pour l&#39;expression transitoire de protéines. Il va grandement faciliter le développement de protéines pharmaceutiques et de promouvoir l&#39;enseignement des sciences.

1. L&#39;expression de protéines fluorescentes par infiltration de la seringue Pour démontrer l&#39;efficacité de la seringue infiltration d&#39;Agrobacterium dans les tissus de la plante, nous avons testé l&#39;expression de deux protéines fluorescentes - GFP et DsRed - par deux plantes vecteurs viraux différents déconstruits - geminiviral et MagnICON - en N. benthamiana. Pour N. benthamiana feuilles qui ont été entièrement infiltrés avec agrobactérie...

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Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Les plantes offrent un nouveau système pour la production de protéines pharmaceutiques à l&#39;échelle commerciale qui est plus évolutive, rentable et sûre de paradigmes d&#39;expression actuels. Dans cette étude, nous présentons une approche simple et pratique, mais évolutive pour introduire du gène cible contenant<em&gt; Agrobacterium tumefaciens</em&gt; Dans les plantes pour l&#39;expression transitoire de protéines.

Agroinfiltration efficace des plantes pour l&#39;expression transitoire de haut niveau de protéines recombinantes

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

efficient-agroinfiltration-plants-for-high-level-transient-expression

Research

JoVE Journal

Biology

48.1K vues.  Arizona State University. Les plantes offrent un nouveau système pour la production de protéines pharmaceutiques à l'échelle commerciale qui est plus évolutive, rentable et sûre de paradigmes d'expression actuels. Dans cette étude, nous présentons une approche simple et pratique, mais évolutive pour introduire du gène cible contenant Agrobacterium tumefaciens Dans les plantes pour l'expression transitoire de protéines.

Vidéo: Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloration des protéines dans les gels de Coomassie G-250, sans solvant et l&#39;acide acétique organique

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Recherche

Biologie

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and easy to use expression system.
As a single-celled microorganism P. pastoris is easy to manipulate and grows rapidly on inexpensive media at high cell densities. Being a eukaryote, P. pastoris is able to perform many of the post-translational modifications performed by higher eukaryotic cells and the obtained recombinant proteins undergo protein folding, proteolytic processing, disulfide bond formation and glycosylation [1].
As a methylotrophic yeast P. pastoris is capable of metabolizing methanol as its sole carbon source. The strong promoter for alcohol oxidase, AOX1, is tightly regulated and induced by methanol and it is used for the expression of the gene of interest. Accordingly, the expression of the foreign protein can be induced by adding methanol to the growth medium [2; 3].
Another important advantage is the secretion of the recombinant protein into the growth medium, using a signal sequence to target the foreign protein to the secretory pathway of P. pastoris. With only low levels of endogenous protein secreted to the media by the yeast itself and no added proteins to the media, a heterologous protein builds the majority of the total protein in the medium and facilitates following protein purification steps [3; 4].
The vector used here (pPICZ&alpha;A) contains the AOX1 promoter for tightly regulated, methanol-induced expression of the gene of interest; the &alpha;-factor secretion signal for secretion of the recombinant protein, a Zeocin resistance gene for selection in both E. coli and Pichia and a C-terminal peptide containing the c-myc epitope and a polyhistidine (6xHis) tag for detection and purification of a recombinant protein. We also show western blot analysis of the recombinant protein using the specific Anti-myc-HRP antibody recognizing the c-myc epitope on the parent vector.

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

The protocol describes protein expression using the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The preparation of electrocompetent yeast cells, transformation of the vector with the gene of interest into P. pastoris and yeast DNA purification are also performed. Western blot analysis and protein purification build the last steps in this protein expression protocol.

Expression de protéines recombinantes dans le levure méthylotrophe<emPichia pastoris></em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

À haut débit Affinity Purification de protéines recombinantes-étiquette

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

La production efficace et purification de recombinant murin Kindlin-3 à partir de cellules d&#39;insectes pour les études biophysiques

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

High Throughput Screening Expression quantitative et purification appliquée à recombinant disulfure riches protéines venin produit dans<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past years, hydrodynamic gene delivery (HGD) has emerged as a simple, fast, safe and effective method for delivering transgenes into rodents. This technique relies on the force generated by the rapid injection of a large volume of physiological solution to increase the permeability of cell membranes of perfused organs and thus deliver DNA into cells. One of the main advantages of HGD is the ability to introduce transgenes into mammalian cells using naked plasmid DNA (pDNA). Introducing an exogenous gene using a plasmid is minimally laborious, highly efficient and, contrary to viral carriers, remarkably safe. HGD was initially used to deliver genes into mice, it is now used to deliver a wide range of substances, including oligonucleotides, artificial chromosomes, RNA, proteins and small molecules into mice, rats and, to a limited degree, other animals. This protocol describes HGD in mice and focuses on three key aspects of the method that are critical to performing the procedure successfully: correct insertion of the needle into the vein, the volume of injection and the speed of delivery. Examples are given to show the application of this method to the transient expression of two genes that encode secreted, primate-specific proteins, apolipoprotein L-I (APOL-I) and haptoglobin-related protein (HPR).

In vivo transfection of naked DNA by hydrodynamic gene delivery introduces genes into the tissue of an animal with minimal inflammatory response. Sufficient amounts of gene product are generated such that gene function and regulation as well as protein structure and function can be analyzed.

Expression transitoire de protéines par hydrodynamique Gene livraison chez la souris

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is the challenge of identifying suitable vaccine candidates. Malarial proteins expressed using prokaryotic and eukaryotic cell based expression systems are poorly glycosylated, generally insoluble and undergo improper folding leading to reduced immunogenicity. The wheat germ, rabbit reticulocyte lysate and Escherichia coli lysate cell free expression systems are currently used for expression of malarial proteins. However, the length of expression time and improper glycosylation of proteins still remains a challenge. We demonstrate expression of Plasmodium proteins in vitro using HeLa based cell free expression systems, termed &#8220;in vitro human cell free expression systems&#8221;. The 2 HeLa based cell free expression systems transcribe mRNA in 75 min and 3 &#181;l of transcribed mRNA is sufficient to translate proteins in 90 min. The 1-step expression system is a transcription and translation coupled expression system; the transcription and co-translation occurs in 3 hr. The process can also be extended for 6 hr by providing additional energy. In the 2-step expression system, mRNA is first transcribed and then added to the translation mix for protein expression. We describe how to express malaria proteins; a hydrophobic PF3D7_0114100 Maurer&#8217;s Cleft &#8211; 2 transmembrane (PfMC-2TM) protein, a hydrophilic PF3D7_0925900 protein and an armadillo repeats containing protein PF3D7_1361800, using the HeLa based cell free expression system. The proteins are expressed in micro volumes employing 2-step and 1-step expression strategies. An affinity purification method to purify 25 &#181;l of proteins expressed using the in vitro human cell free expression system is also described. Protein yield is determined by Bradford&#8217;s assay and the expressed and purified proteins can be confirmed by western blotting analysis. Expressed recombinant proteins can be used for immunizations, immunoassays and protein sequencing.

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Expression of malarial proteins in cell based systems remains challenging. We demonstrate two step and one step IVT (in vitro translation) cell free expression systems for expressing malarial recombinant rhoptry proteins from HeLa cells. We use a Ni-resin affinity based purification system to purify the rhoptry proteins.

Systèmes cellules HeLa base de la libre expression pour l&#39;expression des<em&gt; Plasmodium</em&gt; rhoptries Protéines

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

High Yield expression de protéines recombinantes humaines avec la transfection transitoire de cellules HEK293 en suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and the determination of the biochemical function of proteins at the sub-organismal level. Although baculovirus expression systems are increasingly used for protein production in numerous biotechnological, pharmaceutical, and industrial applications, nonlytic systems that do not involve viral infection have clear benefits but are often overlooked and underutilized. Here, we describe a method for generating nonlytic expression vectors and transient recombinant protein expression. This protocol allows for the efficient cellular localization of recombinant proteins and can be used to rapidly discern protein trafficking within the cell. We show the expression of four&#160;recombinant proteins in a commercially available insect cell line, including two aquaporin proteins from the insect Bemisia tabaci, as well as subcellular marker proteins specific for the cell plasma membrane and for intracellular lysosomes. All recombinant proteins were produced as chimeras with fluorescent protein markers at their carboxyl termini, which allows for the direct detection of the recombinant proteins. The double transfection of cells with plasmids harboring constructs for the genes of interest and a known subcellular marker allows for live cell imaging and improved validation of cellular protein localization.

Nonlytic insect cell expression systems are underutilized for production, cellular trafficking/localization, and recombinant protein functional analysis. Here, we describe methods to generate expression vectors and subsequent transient protein expression in commercially available lepidopteran cell lines. The co-localization of Bemisia tabaci aquaporins with subcellular fluorescent marker proteins is also presented.

Expression transitoire et localisation cellulaire des protéines recombinantes dans les cellules d&#39;insectes Cultured

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Transformation transitoire in planta de plants de cacao à l’aide d’Agrobacterium tumefaciens

Vacuum-Forced Agroinfiltration for In planta Transformation of Recalcitrant Plants: Cacao as a Case Study

Transient in planta transformation is a fast and cost-effective alternative for plant genetic transformation. Most protocols for in planta transformation rely on the use of Agrobacterium-mediated transformation. However, the protocols currently in use are standardized for small-sized plants due to the physical and economic constraints of submitting large-sized plants to a vacuum treatment. This work presents an effective protocol for localized vacuum-based agroinfiltration customized for large-sized plants. To assess the efficacy of the proposed method, we tested its use in cacao plants, a tropical plant species recalcitrant to genetic transformation. Our protocol allowed applying up to 0.07 MPa vacuum, with repetitions, to a localized aerial part of cacao leaves, making it possible to force the infiltration of Agrobacterium into the intercellular spaces of attached leaves. As a result, we achieved the Agrobacterium-mediated transient in planta transformation of attached cacao leaves expressing for the RUBY reporter system. This is also the first Agrobacterium-mediated in planta transient transformation of cacao. This protocol would allow the application of the vacuum-based agroinfiltration method to other plant species with similar size constraints and open the door for the in planta characterization of genes in recalcitrant woody, large-size species.

Pleins feux sur l’auteur : Transformation induite par des agrobactéries sans culture tissulaire chez les grandes plantes ligneuses

Here, we present the first protocol for localized vacuum infiltration for in vivo studies of the genetic transformation of large-sized plants. Using this methodology, we achieved for the first time the Agrobacterium-mediated in planta transient transformation of cacao.

Agro-infiltration forcée sous vide pour la transformation in planta de plantes récalcitrantes : le cacao comme étude de cas

Transient in planta transformation is a fast and cost-effective alternative for plant genetic transformation. Most protocols for in planta transformation ...

Methods Article

Agroinfiltration efficace des plantes pour l'expression transitoire de haut niveau de protéines recombinantes