Cette recherche a été financée en partie par le programme de recherche intra-muros des NIH, NIDCD to M.H. (DC000088)

Toutes les expériences et procédures sur les animaux ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Institut national des maladies neurologiques et des accidents vasculaires cérébraux et l’Institut national sur la surdité et autres troubles de la communication, National Institutes of Health. Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Institut national des maladies neurologiques et des accidents vasculaires cérébraux et l’Institut national sur la surdité et autres troubles de la communication, National Institutes of Health. Toutes les méthodes ont été appliquées conformément aux directives et règlements pertinents du Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Institut national des maladies neurologiques et des accidents vasculaires cérébraux et de l’Institut national sur la surdité et autres troubles de la communication, National Institutes of Health.
1. Euthanasie animale
<ol><li>Utilisez des souris transgéniques C57BL/6J ou Kcnj10-ZsGreen, jour 30+ postnatal (P30+), qui pèsent entre 15 et 20 g.</li>
	<li>Euthanasier une souris adulte (âge P30 ou plus) en utilisant un protocole approuvé (ici l’asphyxie au CO2 ). Effectuez la décapitation comme étape secondaire. REMARQUE: En cas d’immunomarquage, certains anticorps peuvent avoir un signal de fond en raison d’une liaison non spécifique au sang dans les capillaires de la SV. La perfusion cardiaque avec fixateur peut résoudre ce problème en retirant le sang des capillaires du SV. Cependant, la plupart des anticorps peuvent obtenir de bons résultats sans cette méthode, et elle ne sera pas couverte par ce protocole.</li>
</ol>2. Exposer le labyrinthe osseux
<ol><li>Nettoyez la souris en pulvérisant avec de l’éthanol à 70% et en l’essuyant avec une serviette en papier. Portez une attention particulière à la région de la tête pour réduire le risque de contamination. Enlevez la peau du crâne en tirant la peau vers le nez.</li>
	<li>À l’aide de ciseaux tranchants, fendez le crâne le long du plan médio-sagittal pour séparer les parties gauche et droite.</li>
	<li>Retirez le cerveau du crâne pour exposer le labyrinthe osseux.</li>
</ol>3. Extraction de l’oreille interne
<ol><li>Identifiez l’oreille interne dans l’os temporal (Figure 2A) et grattez les nerfs crâniens à l’aide d’une pince #55. REMARQUE: L’utilisateur doit stabiliser l’échantillon avec sa main non dominante à l’aide d’un deuxième jeu de pinces #55. Différentes zones de l’échantillon peuvent être saisies avec la pince stabilisatrice tout au long de la dissection si les zones critiques de l’échantillon sont évitées (p. ex., ne pas écraser la cochlée).</li>
	<li>À l’aide de la pince #55, disséquez la bulle et la capsule, en les détachant de l’os environnant. Retirez tous les tissus mous restants de la surface de l’oreille interne.</li>
	<li>Transférer l’échantillon dans une boîte de culture tissulaire transparente contenant 1x PBS froid (solution saline tamponnée au phosphate), pH 7,4, et placer sous une lunette de dissection (figure 2B).</li>
</ol>4. Dissection SV
REMARQUE: Avec de la pratique, il est possible de disséquer le SV comme une longue pièce ressemblant à un ruban. Le SV est fragile, donc s’il se brise en morceaux, ceux-ci peuvent être stockés ensemble. Alternativement, ceux-ci peuvent être stockés dans des puits étiquetés séparément en fonction de leur tour (par exemple, basal, moyen, apical).
<ol><li>Si les sources lumineuses de la lunette de dissection peuvent être déplacées, placez une lumière au-dessus de l’antenne parabolique et la deuxième source lumineuse sur le côté, parallèlement à la surface de dissection. Cela permet un meilleur contraste du tissu sous l’os cochléaire.</li>
	<li>À l’aide d’une pince #55, tenez le spécimen par la partie vestibulaire avec la cochlée tournée vers le haut.</li>
	<li>À l’aide de la pince #55, percez l’os cochléaire à l’apex. REMARQUE: Les pinces #5 sont plus épaisses que #55 et peuvent être utilisées pour casser les os, mais l’augmentation de la taille / force sacrifie la finesse des pinces et la capacité de manipuler de petits tissus. Envisagez d’utiliser des pinces fabriquées avec un matériau tel que l’inox ou le dumostar pour éviter les dommages qui pourraient survenir aux pinces plus délicates. Évitez d’enfoncer la pince trop profondément sous l’os pour éviter d’endommager le SV.</li>
	<li>À l’aide de la pince #55, gratter le long du tour apical (Figure 2C), en appliquant une force douce pour détacher de petits morceaux de la couche osseuse externe. Soulevez doucement l’os et détachez-le de la paroi latérale. NOTE: Il peut être utile de penser à cette dissection comme « enlever tout du SV », plutôt que de « disséquer le SV hors de la cochlée ».</li>
	<li>Continuez à utiliser les pinces #55 pour retirer les morceaux d’os cochléaire des tours apical et moyen (Figure 2D,E). En poussant doucement le long de la paroi latérale, soulevez et retirez les morceaux de paroi osseuse vers le virage du milieu pour exposer la paroi latérale des virages apical et moyen.</li>
	<li>En continuant à utiliser la pince #55, poussez doucement la paroi latérale du virage apical de côté pour exposer le ganglion en spirale. Détachez la paroi latérale des spires apicales et moyennes du ganglion en spirale le long de la couche externe des cellules ciliées. Retirez des morceaux de ganglion en spirale de l’intérieur de la cochlée. REMARQUE: Les pinces #55 sont plus petites et offrent un avantage lors de la manipulation de tissus petits et délicats. Des précautions supplémentaires doivent être prises pour éviter de les plier ou de les endommager.</li>
	<li>Pour avoir un meilleur accès à la paroi latérale du tour basal, détachez la cochlée de la partie vestibulaire de l’os temporal à l’aide d’une pince #55. Placez la pince #55 dans la fenêtre ronde et ovale et poussez vers le bas vers le vestibule. La cochlée se détachera. Retirez la partie vestibulaire de l’oreille interne.</li>
	<li>En continuant à utiliser les pinces #55, retirez maintenant les morceaux d’os cochléaire basal, en commençant par la zone de virage du milieu. Poussez doucement la couche de paroi latérale sous l’os pour le détacher.</li>
	<li>Enlevez la partie basale la plus éloignée de la paroi latérale en retirant et en tirant doucement le tissu. L’os dans cette région peut être trop épais pour être enlevé sans endommager les tissus mous en dessous.</li>
	<li>Maintenant, avec la partie basale de la paroi latérale détachée, séparez autant que possible la paroi latérale de la cochlée. Cela peut être fait en traçant la pince #55 le long de la paroi latérale. Brossez doucement la pince entre l’os et la paroi latérale restante. Cela peut être fait jusqu’au sommet en un seul morceau si l’utilisateur est expérimenté. Déplacez la paroi latérale vers un nouveau PBS. REMARQUE : Bien que les plus gros morceaux de SV puissent être plus faciles à imager, étant donné la nature délicate des tissus, des morceaux plus petits peuvent être prélevés (Figure 2F, G) et, selon la taille, peuvent également fonctionner pour l’imagerie.</li>
	<li>Utilisez des pinces #55 pour poser la paroi latérale à plat. Le SV doit être visible sous la forme d’une couche de tissu plus foncée sur le côté interne de la paroi latérale. REMARQUE : Les utilisateurs peuvent constater, particulièrement près de l’extrémité apicale, qu’une partie du tissu SV se détache accidentellement de la paroi latérale tout au long de la dissection.</li>
	<li>Retirez doucement la couche SV pour la détacher de la paroi latérale à son extrémité basale (Figure 2H). Écartez doucement le SV détaché et déplacez la pince plus loin vers l’extrémité apicale de la paroi latérale, en détachant le SV comme un long ruban si possible (Figure 2I). Ne pressez pas le SV avec une pince pour le tirer. Si le tissu est trop fragile pour être saisi, il peut également être prélevé à l’aide d’une cuillère de tissu, telle qu’une curette chalazion. REMARQUE: Le déplacement du SV doit toujours être effectué sous microscopie optique pour s’assurer qu’il n’est pas perdu. Soyez toujours prudent lorsque vous saisissez à l’aide de forceps en raison du risque de dommages. Les utilisateurs peuvent constater que l’utilisation de chalazion curette atténue le risque de dommages aux tissus SV. Pour le séquençage mononoyau, passez à la section 5. Pour l’immunocoloration par SV, passez à la rubrique 7.</li>
</ol>5. Suspension mononoyau SV
REMARQUE: Ce protocole est adapté pour le tissu SV spécifiquement à partir d’un protocole de suspension mononoyau publié par le fabricant. Des plates-formes de différents fabricants peuvent être utilisées31. Compte tenu des variations propres à la plate-forme, il est recommandé de revoir le protocole spécifique au fabricant fourni avec l’équipement. Pour obtenir des résultats optimaux pour sNuc-Seq et minimiser la dégradation de l’ARN, plus la dissection tissulaire est rapide, mieux c’est (recommandé dans les 15 à 20 minutes suivant l’euthanasie). Il peut être utile d’euthanasier un animal à la fois et seulement lorsqu’il est prêt à le disséquer. Le fait que plusieurs personnes travaillent simultanément sur les dissections peut également éliminer le temps de dégradation (p. ex., un membre du personnel de laboratoire travaille sur l’oreille gauche tandis qu’un autre travaille sur l’oreille droite).
<ol><li>Si le tissu SV doit être utilisé pour le sNuc-Seq, placer le tissu dans un tampon de lyse réfrigéré (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,005% nonidet P40 dans de l’eau sans nucléase). REMARQUE : Si le séquençage doit être effectué immédiatement après la dissection, poursuivez le protocole. Si l’on souhaite mettre en pause le protocole, la préservation de SV est possible en plaçant le SV dans RNAlater. Conserver toute la nuit à 4 °C, puis congeler dans de l’azote liquide et conserver à -80 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à être utilisé. Lorsque vous êtes prêt à l’emploi, décongeler et laver deux fois dans du PBS pendant 5 minutes chacun, puis procéder à l’homogénéisation (étape 5.2).</li>
	<li>Homogénéiser le tissu dans un homogénéisateur de rebond de 2 ml avec 10-20 coups sur la glace. REMARQUE: Le cylindre de verre entrera en contact manuellement avec le fond du tube de verre, fragmentant le SV. Le SV est délicat, donc 20 coups permettent généralement une homogénéisation réussie.</li>
	<li>Lyser le tissu sur la glace pendant 25 min. REMARQUE: Le temps de lyse varie selon le type de tissu. Une lyse de 25 minutes dans le tissu SV peut atteindre une faible viabilité cellulaire (moins de 4%), mais le temps peut être adapté si la viabilité cellulaire est trop élevée (étape 5.8).</li>
	<li>Filtrer à travers un filtre de 30 μm et faire tourner le filtrat à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.</li>
	<li>Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de tampon de lavage et de remise en suspension des noyaux (1x PBS, albumine sérique bovine à 1 % [BSA], inhibiteur de la RNase 0,2U/μL).</li>
	<li>Filtrer les cellules à travers un filtre de 10 μm et centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.</li>
	<li>Retirer le surnageant et remettre en suspension dans 50 μL de tampon de lavage et de remise en suspension des noyaux.</li>
	<li>Compter les noyaux à l’aide d’un compteur de cellules et d’une coloration bleue au trypan. Diluer 5 μL de la suspension cellulaire dans 50 μL de 1x PBS pour le comptage cellulaire; La viabilité devrait être minime (3 % à 4 %) à ce stade. Si la viabilité s’avère plus élevée, adapter le protocole pour l’étape 5.3 (lyse) et normaliser le temps de lyse pour assurer une lyse adéquate des cellules. REMARQUE: Une viabilité cellulaire élevée dans une préparation à un seul noyau signifie qu’il y a plus de cellules intactes que souhaité, et qu’une digestion supplémentaire peut être nécessaire.</li>
	<li>Chargez l’échantillon avec la densité nucléaire souhaitée sur l’appareil/puce du fabricant (voir le guide du fabricant). Les captures à noyau unique sont maintenant prêtes. REMARQUE : À partir d’une souris adulte SV, on obtient habituellement 50 μL de la suspension à une concentration de 150 000 noyaux/mL.</li>
</ol>6. Séquençage mononoyau SV
<ol><li>Envoyez les échantillons à l’installation centrale pour le séquençage. REMARQUE: Cette partie du protocole suit les étapes générales de (1) la génération et le codage à barres de l’émulsion de billes de gel (GEM), (2) le nettoyage post-GEM-RT et l’amplification de l’ADNc, et (3) la construction de la bibliothèque d’expression génique 3'. Le reste du protocole sNuc-Seq est relativement long, et il est recommandé aux lecteurs d’utiliser leur protocole spécifique au fabricant. Le guide du fabricant décrira probablement les étapes avec des détails spécifiques et des images d’accompagnement. Il peut également y avoir des vidéos pratiques sur le site Web du fabricant. Les ensembles de données générés peuvent être représentés de manière dimensionnelle réduite, telle qu’une approximation et une projection de variété uniforme (UMAP; Graphique 3). De nombreux laboratoires utilisent un noyau de séquençage qui peut exécuter ce protocole pour les utilisateurs.</li>
</ol>7. Immunomarquage SV et montage tissulaire
<ol><li>Si le tissu doit être utilisé pour l’immunomarquage, transférez-le dans une plaque de 24 puits, immergée dans 200 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4% dans 1x PBS et incuber pendant 20 minutes à température ambiante. REMARQUE: Il est utile d’effectuer tout l’élimination des liquides, le lavage et l’immunocoloration sous un microscope. La visualisation lors du pipetage du tissu garantira qu’il n’est pas perdu accidentellement lors de l’élimination du liquide. Les volumes des anticorps et des lavages peuvent être ajustés tant que le volume est suffisamment important pour immerger le tissu SV dans la solution.</li>
	<li>Après l’étape de fixation, retirer le PFA en effectuant deux courts lavages dans 1x PBS (environ 500 μL) à 4 °C pendant 5 minutes chacun sur un agitateur orbital à bas régime (30-50) RPM. En cas de stockage, le tissu peut être stocké dans 1x PBS à 4 °C.</li>
	<li>Retirer le PBS et perméabiliser et bloquer pendant au moins 1 h à température ambiante dans environ 300 μL de solution PBS-T (0,05 Tween20 dans 1x PBS avec 10% de sérum fœtal bovin). REMARQUE : Les anticorps primaires et secondaires doivent être dilués dans cette solution bloquante.</li>
	<li>Colorer le tissu avec l’anticorps primaire selon les spécifications de l’anticorps particulier utilisé, généralement pendant une nuit à 4 ° C. Retirez le PBS restant et ajoutez l’anticorps primaire dilué. NOTA: La dilution doit être choisie en fonction des suggestions du fabricant, des données publiées, de l’expérience antérieure, etc. Habituellement, la première concentration à tester est une dilution de 1:100-200. Pour l’exemple présenté dans cet article, les anticorps GS-IB4 et DAPI ont chacun été dilués à 1:200. En cas de coloration pour plus d’une protéine, plusieurs anticorps primaires peuvent être combinés dans la même solution, à condition que chaque anticorps primaire ait un hôte différent pour éviter la réactivité croisée des anticorps secondaires.</li>
	<li>Laver l’anticorps primaire du tissu en utilisant environ 500 μL de 1x PBS deux fois pendant 10 minutes chacun sur un agitateur orbital à bas régime. REMARQUE : Continuez à vous assurer que le tissu SV est immergé dans la solution et non coincé sur le côté du puits.</li>
	<li>Coloration avec un anticorps secondaire selon les spécifications de l’anticorps particulier utilisé, généralement pendant 2 h à température ambiante sur un agitateur orbital à bas régime. Couvrir la plaque de 24 puits afin que l’anticorps secondaire marqué par fluorescence soit protégé de la lumière. REMARQUE : Si plus d’un anticorps secondaire est nécessaire, combinez les anticorps secondaires dans la même solution. Assurez-vous d’éviter l’étiquetage croisé.</li>
	<li>Laver l’anticorps secondaire du tissu en utilisant environ 500 μL de 1x PBS quatre fois pendant 5 minutes chacun sur un agitateur orbital à bas régime. Gardez la plaque de 24 puits couverte pour la protéger de la lumière.</li>
	<li>Préparez la plus grande lame microscopique (75 mm x 25 mm) en plaçant deux petites traînées de colle le long de l’axe de 25 mm, juste plus petites que la lamelle de verre plus petite de 18 mm x 18 mm. Placez une goutte de réactif de montage (environ 50 μL) entre les traînées de colle. REMARQUE: La colle crée une petite quantité d’espace vertical de sorte que lorsque le deuxième couvercle est placé sur le dessus, l’échantillon de tissu SV peut exister en toute sécurité, mais continuer à rester en place. Bien que l’épaisseur de la strie soit de 30 à 40 microns, il faut éviter de presser le tissu entre les surfaces vitrées pour préserver la morphologie. Alternativement, du ruban adhésif transparent peut également être utilisé.</li>
	<li>À l’aide de pinces #55, saisir le moins de tissu possible à une extrémité du SV et transférer du PBS à la goutte de réactif de montage sur la plus grande microlame (75 mm x 25 mm). Placez une extrémité d’une petite glissière de verre (18 mm x 18 mm) sur la glissière où une traînée de colle a été placée et relâchez-la doucement pour éviter de créer des bulles d’air. Le couvercle tombera sur l’autre traînée de colle et couvrira le tissu SV.</li>
	<li>Scellez le support en tamponnant une goutte de vernis à ongles transparent sur chaque coin du support. Étiquetez l’échantillon en conséquence sur le couvercle en verre loin du champ de visualisation. Il est maintenant prêt pour la microscopie confocale (Figure 4).</li>
	<li>Visualisez le tissu SV à l’aide d’un microscope à dissection pour vous assurer qu’il est posé à plat et non près de bulles d’air. Si le tissu SV n’est pas orienté correctement, l’utilisateur peut tenter d’expulser les bulles d’air ou retirer soigneusement le plus petit capot en verre et repositionner le SV. Cela doit être fait doucement pour éviter de casser les lamelles de couvercle.</li>
</ol>

Microdissection de stries vasculaires pour le séquençage d’un seul noyau ou l’immunocoloration

<ol>
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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+irreversible+hearing+loss+is+caused+by+stria+vascularis+degeneration+in+an+Slc26a4-insufficient+mouse+model+of+large+vestibular+aqueduct+syndrome.">Progressive irreversible hearing loss is caused by stria vascularis degeneration in an Slc26a4-insufficient mouse model of large vestibular aqueduct syndrome.</a> Neuroscience. 310, 188-197 (2015).</li><li>Gu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+rare+spindle+and+root+cell+transcriptional+profiles+in+the+stria+vascularis+of+the+adult+mouse+cochlea.">Characterization of rare spindle and root cell transcriptional profiles in the stria vascularis of the adult mouse cochlea.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18100 (2020).</li><li>Gow, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deafness+in+claudin+11-null+mice+reveals+the+critical+contribution+of+basal+cell+tight+junctions+to+stria+vascularis+function.">Deafness in claudin 11-null mice reveals the critical contribution of basal cell tight junctions to stria vascularis function.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (32), 7051-7062 (2004).</li><li>Chang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virally+mediated+Kcnq1+gene+replacement+therapy+in+the+immature+scala+media+restores+hearing+in+a+mouse+model+of+human+Jervell+and+Lange-Nielsen+deafness+syndrome.">Virally mediated Kcnq1 gene replacement therapy in the immature scala media restores hearing in a mouse model of human Jervell and Lange-Nielsen deafness syndrome.</a> EMBO Molecular Medicine. 7 (8), 1077-1086 (2015).</li><li>Faridi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+and+phenotypic+spectra+of+KCNE1+deficiency+in+Jervell+and+Lange-Nielsen+Syndrome+and+Romano-Ward+Syndrome.">Mutational and phenotypic spectra of KCNE1 deficiency in Jervell and Lange-Nielsen Syndrome and Romano-Ward Syndrome.</a> Human Mutation. 40 (2), 162-176 (2019).</li><li>Wangemann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+KCNJ10+protein+expression+abolishes+endocochlear+potential+and+causes+deafness+in+Pendred+syndrome+mouse+model.">Loss of KCNJ10 protein expression abolishes endocochlear potential and causes deafness in Pendred syndrome mouse model.</a> BMC Medicine. 2, 30 (2004).</li><li>Kitajiri, S. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+patterns+of+claudins,+tight+junction+adhesion+molecules,+in+the+inner+ear.">Expression patterns of claudins, tight junction adhesion molecules, in the inner ear.</a> Hearing Research. 187 (1-2), 25-34 (2004).</li><li>Jagger, D. J., Nevill, G., Forge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+membrane+properties+of+cochlear+root+cells+are+consistent+with+roles+in+potassium+recirculation+and+spatial+buffering.">The membrane properties of cochlear root cells are consistent with roles in potassium recirculation and spatial buffering.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 11 (3), 435-448 (2010).</li><li>Ito, T., Kurata, N., Fukunaga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages+in+the+stria+vascularis.">Tissue-resident macrophages in the stria vascularis.</a> Frontiers in Neurology. 13, 818395 (2022).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFA165+gene+therapy+ameliorates+blood-labyrinth+barrier+breakdown+and+hearing+loss.">VEGFA165 gene therapy ameliorates blood-labyrinth barrier breakdown and hearing loss.</a> JCI Insight. 6 (8), e143285 (2021).</li><li>Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+the+cochlear+intrastrial+fluid-blood+barrier+(review).">Pathophysiology of the cochlear intrastrial fluid-blood barrier (review).</a> Hearing Research. 338, 52-63 (2016).</li><li>Gu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+potential+Meniere's+disease+targets+in+the+adult+stria+vascularis.">Identification of potential Meniere's disease targets in the adult stria vascularis.</a> Frontiers in Neurology. 12, 630561 (2021).</li><li>Fischer, J., Ayers, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+nucleus+RNA-sequencing:+how+it's+done,+applications+and+limitations.">Single nucleus RNA-sequencing: how it's done, applications and limitations.</a> Emerging Topics in Life Sciences. 5 (5), 687-690 (2021).</li><li>Korrapati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+and+single+nucleus+RNA-Seq+reveal+cellular+heterogeneity+and+homeostatic+regulatory+networks+in+adult+mouse+stria+vascularis.">Single cell and single nucleus RNA-Seq reveal cellular heterogeneity and homeostatic regulatory networks in adult mouse stria vascularis.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 316 (2019).</li><li>Pyle, M. P., Hoa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+single-cell+sequencing+for+the+field+of+otolaryngology:+A+contemporary+review.">Applications of single-cell sequencing for the field of otolaryngology: A contemporary review.</a> Laryngoscope Investigative Otolaryngology. 5 (3), 404-431 (2020).</li><li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines.">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).</li><li>Shafer, M. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-species+analysis+of+single-cell+transcriptomic+data.">Cross-species analysis of single-cell transcriptomic data.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 175 (2019).</li><li>Chen, G., Ning, B., Shi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-Seq+technologies+and+related+computational+data+analysis.">Single-cell RNA-Seq technologies and related computational data analysis.</a> Frontiers in Genetics. 10, 317 (2019).</li><li>Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+single-cell+and+spatial+transcriptomics+to+elucidate+intercellular+tissue+dynamics.">Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics.</a> Nature Reviews Genetics. 22 (10), 627-644 (2021).</li><li>Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. A., Lee, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+single-nucleus+RNA+sequencing+in+different+cell+types+and+tissues.">Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues.</a> Journal of Pathology and Translational Medicine. 57 (1), 52-59 (2023).</li><li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-sequencing+from+single+nuclei.">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea.">Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> Journal of Visuazlied Experiments. (107), e53561 (2016).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Avant l’avènement du séquençage unicellulaire, de nombreux chercheurs utilisaient l’analyse tissulaire en vrac, qui ne permettait que d’analyser les transcriptomes moyennés entre les cellules. En particulier, single-cell et sNuc-Seq ont permis d’isoler le transcriptome d’une seule cellule ou d’un seul noyau, respectivement32. Dans ce cas, les transcriptomes mononucléaux peuvent être identifiés pour les cellules marginales, intermédiaires et basales, ainsi que pour les cellules ...

La cochlée se compose de trois chambres remplies de liquide, la scala vestibuli, la scala media et la scala tympan. La scala vestibuli et la scala tympani contiennent chacune de la périlymphe, qui a une forte concentration de sodium (138 mM) et une faible concentration de potassium (6,8 mM)1. La scala media contient de l’endolymphe, qui a une forte concentration de potassium (154 mM) et une faible concentration de sodium (0,91 mM)1,2,3. Cette différence de concentration ionique peut être appelée potentiel endocochléaire (EP) et est principalement générée par le mouvement des ions potassium à travers divers canaux ioniques et jonctions lacunaires dans la strie vasculaire (SV) le long de la paroi latérale de la cochlée 4,5,6,7,8,9,10,11 . Le SV est un tissu hétérogène hautement vascularisé qui tapisse la face médiale de la paroi latérale de la cochlée et contient trois principaux types de cellules : les cellules marginales, intermédiaires et basales12 (Figure 1).
Les cellules marginales sont reliées par des jonctions serrées pour former la surface la plus médiale du SV. La membrane apicale fait face à l’endolymphe de la scala moyenne et contribue au transport des ions potassium dans l’endolymphe en utilisant divers canaux, y compris KCNE1 / KCNQ1, SLC12A2 et Na+-K+-ATPase (NKA)5,10,13,14. Les cellules intermédiaires sont des cellules pigmentées qui résident entre les cellules marginales et basales et facilitent le transport du potassium à travers le SV en utilisant KCNJ10 (Kir 4.1)15,16. Les cellules basales se trouvent à proximité de la paroi latérale de la cochlée et sont étroitement associées aux fibrocytes du ligament spiralé pour favoriser le recyclage du potassium de la périlymphe12. La pathologie du SV a été impliquée dans de nombreux troubles otologiques17,18. Les mutations dans les gènes exprimés dans les principaux types de cellules SV, tels que Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 et Cldn11, peuvent causer la surdité et le dysfonctionnement de SV, y compris la perte de EP 19,20,21,22,23. En plus des trois principaux types cellulaires, il existe d’autres types de cellules moins étudiés dans le SV, tels que les cellules fusiformes 22, les cellules racinaires12,24, les macrophages 25, les péricytes 26 et les cellules endothéliales 27, qui ont des rôles incomplètement définis impliquant l’homéostasie ionique et la génération de EP 28.
Par rapport au séquençage de l’ARN en vrac, le séquençage de l’ARN à noyau unique (sNuc-Seq) fournit des informations sur l’hétérogénéité cellulaire, plutôt qu’une moyenne de l’ARNm dans un groupe de cellules29, et peut être particulièrement utile lors de l’étude de l’hétérogène SV30. Par exemple, sNuc-Seq a produit une analyse transcriptionnelle qui suggère qu’il pourrait y avoir un rôle pour les cellules fusiformes et racinaires dans la génération de PE, la perte auditive et la maladie de Ménière18. Une caractérisation transcriptionnelle plus poussée des différents types de cellules SV peut nous fournir des informations précieuses sur la physiopathologie sous-jacente aux différents mécanismes et sous-types de fluctuation auditive et de perte auditive liée à la SV. La récolte de ces structures délicates de l’oreille interne est d’une importance primordiale pour une analyse tissulaire optimale.
Dans cette étude, l’approche de microdissection pour accéder à la strie vasculaire et l’isoler de la cochlée de souris adulte pour sNuc-Seq ou immunomarquage est décrite. La dissection de la SV de souris adulte est nécessaire pour comprendre divers types de cellules SV et caractériser davantage leur rôle dans l’audition.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >10-&#181;m filter (Polyethylenterephthalat)</td>
			<td >PluriSelect</td>
			<td >#43-50010-01</td>
			<td >Filter tissue during sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >18 x 18 mm cover glass</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >12-541A</td>
			<td >Cover slip to mount SV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >30-&#181;m filter (Polyethylenterephthalat)</td>
			<td >PluriSelect</td>
			<td >#43-50030-03</td>
			<td >Filter tissue during sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide</td>
			<td >Daigger</td>
			<td >EF15978Z</td>
			<td >Microslide to mount SV on</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C57BL/6J Mice</td>
			<td >The Jackson Laboratory</td>
			<td >RRID: IMSR_JAX:000664</td>
			<td >General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Counter</td>
			<td >Logos Biosystems</td>
			<td >L20001</td>
			<td >Used for cell counting</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chalizon curette 5&#39;&#39;, size 3 2.5 mm</td>
			<td >Biomedical Research Instruments</td>
			<td >15-1020</td>
			<td >Used to transfer SV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chromium Next GEM single Cell 3&#39; GEM Kit v3.1</td>
			<td >Chromium</td>
			<td >PN-1000141</td>
			<td >Generates single cell 3&#39; gene expression libraries</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear nail polish</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >NC1849418</td>
			<td >Used for sealing SV mount</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well</td>
			<td >Corning</td>
			<td >08-772B</td>
			<td >Culture dish used to hold specimen during dissection</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >D1306, RRID: AB_2629482</td>
			<td >Stain used for nucleus labeling</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dounce homogenizer</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D8938</td>
			<td >Used to homogenize tissue for sNuc-seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dumont #5 Forceps</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td >11252-30</td>
			<td >General forceps for dissection</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dumont #55 Forceps</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td >11255-20</td>
			<td >Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >16000044</td>
			<td >Used for steps of sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glue stick</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >NC0691392</td>
			<td >Used for mounting SV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GS-IB4 Antibody</td>
			<td >Molecular Probes</td>
			<td >I21411, RRID: AB-2314662</td>
			<td >Antibody used for capillary labeling</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >KCNJ10-ZsGreen Mice</td>
			<td >n/a</td>
			<td >n/a</td>
			<td >Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MgCl2</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >AM9530G</td>
			<td >Used for steps of sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mounting reagent</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#S36940</td>
			<td >Mounting reagent for SV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Multiwell 24 well plate</td>
			<td >Corning</td>
			<td >#353047</td>
			<td >Plate used for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaCl</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >AAJ216183</td>
			<td >Used for steps of sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nonidet P40</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >9-16-45-9</td>
			<td >Used for steps of sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclease free water</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >4387936</td>
			<td >Used for steps of sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Orbital shaker</td>
			<td >Silent Shake</td>
			<td >SYC-2102A</td>
			<td >Used for steps of immunostaining</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >J61196.AP</td>
			<td >Used for steps of immunostaining and dissection</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNA Later</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >AM7021</td>
			<td >Used for preservation of SV for sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scizzors</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td >14058-09</td>
			<td >Used for splitting mouse skull</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris-HCl</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >15506017</td>
			<td >Used for steps of sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypan blue stain</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15250061</td>
			<td >Used for cell counting</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tween20</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >AAJ20605AP&#160;</td>
			<td >Used for steps of sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >n/a</td>
			<td >Microscope used for dissections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of adult mouse stria vascularis for single-nucleus sequencing or immunostaining

Le potentiel endocochléaire, qui est généré par la strie vasculaire, est essentiel pour maintenir un environnement propice à une mécanotransduction appropriée des cellules ciliées et, finalement, à l’audition. Les pathologies de la strie vasculaire peuvent entraîner une diminution de l’audition. La dissection de la strie vasculaire adulte permet la capture focalisée d’un seul noyau, puis le séquençage et l’immunomarquage d’un seul noyau. Ces techniques sont utilisées pour étudier la physiopathologie de la strie vasculaire au niveau unicellulaire. 
Le séquençage mononucléal peut être utilisé dans le cadre de l’analyse transcriptionnelle de la strie vasculaire. Pendant ce temps, l’immunomarquage continue d’être utile pour identifier des populations spécifiques de cellules. Les deux méthodes nécessitent une dissection appropriée de la strie vasculaire comme condition préalable, ce qui peut s’avérer techniquement difficile.

The cochlea consists of three fluid filled chambers, the scala vestibuli, scala media, and scala tympani. The scala vestibuli and scala tympani each contain perilymph, which has a high concentration of sodium (138 mM) and a low concentration of potassium (6.8 mM)1. The scala media contains endolymph, which has a high concentration of potassium (154 mM) and a low concentration of sodium (0.91 mM)1,2,3. This difference in ion concentration can be referred to as the endocochlear potential (EP), and is primarily generated by the movement of potassium ions through various ion channels and gap junctions in the stria vascularis (SV) along the lateral wall of the cochlea4,5,6,7,8,9,10,11. The SV is a heterogenous, highly vascularized tissue that lines the medial aspect of the lateral wall of the cochlea and contains three main cell types: marginal, intermediate, and basal cells12 (Figure 1).
Marginal cells are connected by tight junctions to form the most medial surface of the SV. The apical membrane faces the endolymph of the scala media and contributes to potassium ion transport into the endolymph using various channels, including KCNE1/KCNQ1, SLC12A2, and Na+-K+-ATPase (NKA)5,10,13,14. Intermediate cells are pigmented cells that reside between marginal and basal cells and facilitate potassium transport through the SV using KCNJ10 (Kir 4.1)15,16. Basal cells lie in close proximity to the lateral wall of the cochlea and are closely associated with fibrocytes of the spiral ligament to promote potassium recycling from the perilymph12. Pathology of the SV has been implicated in numerous otologic disorders17,18. Mutations in genes expressed in the major SV cell types, such as Kcnq1, Kcne1, Kcnj10, and Cldn11, can cause deafness and SV dysfunction, including the loss of EP19,20,21,22,23. In addition to the three major cell types, there are other less-studied cell types in the SV, such as spindle cells22, root cells12,24, macrophages25, pericytes26, and endothelial cells27, that have incompletely defined roles involving ionic homeostasis and the generation of EP28.
In comparison to bulk RNA-sequencing, single-nuclei RNA-sequencing (sNuc-Seq) provides information about cell heterogeneity, rather than an average of mRNA across a group of cells29, and can be particularly useful when studying the heterogenous SV30. For example, sNuc-Seq has produced transcriptional analysis that suggests there may be a role for spindle and root cells in EP generation, hearing loss, and Meniere&#39;s disease18. Further transcriptional characterization of the various SV cell types can provide us with invaluable information on the pathophysiology underlying different mechanisms and subtypes of SV-related hearing fluctuation and hearing loss. The harvest of these delicate inner ear structures is of paramount importance to optimal tissue analysis.
In this study, the microdissection approach to access and isolate the stria vascularis from the adult mouse cochlea for sNuc-Seq or immunostaining is described. Dissection of the adult mouse SV is required to understand various SV cell types and further characterize their role in hearing.

Pleins feux sur l’auteur : Dissection de stria vascularis de souris adultes pour le séquençage d’un seul noyau ou l’immunomarquage  

Dissection de la strie vasculaire de souris adulte pour le séquençage mononucléaire ou l’immunomarquage

The stria vascularis functions to generate the endocochlear potential and regulate ion homeostasis in the cochlea. The auditory development and restoration program seeks to understand the underlying mechanisms connecting dysfunctional ion homeostasis with hearing and stability disorders, which are diseases where either fluctuation in or sudden hearing loss occurs. Work in my lab has established the transcriptional landscape of the stria vascularis and has contributed to our understanding of its importance in hearing.We have used these data to draw parallels to poorly-understood hearing and stability disorders, including Meniere's disease. This protocol enables the dissection and isolation of whole-mount stria vascularis for further molecular studies including immunohistochemistry. Given that stria vascularis cell types are intricately intertwined with one another, the use of nuclear isolation and single-nucleus RNA sequencing has facilitated our understanding of the distinct transcriptional machinery involved.

Nous présentons une méthode pour isoler le SV à utiliser pour le sNuc-Seq ou l’immunomarquage. L’anatomie pertinente (Figure 1) de la cochlée par rapport à la SV peut aider les utilisateurs à mieux comprendre l’organisation de la SV et les étapes du protocole de dissection.
Chaque étape de cette microdissection de SV à partir d’une souris P30 est détaillée dans la vidéo associée, et des instantanés des étapes clés de cette dissection et de ...

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La strie vasculaire est vitale pour la génération du potentiel endocochléaire. Ici, nous présentons la dissection de la strie vasculaire de la souris adulte pour le séquençage mononucléaire ou l’immunomarquage.

Endocochlear potential, which is generated by the stria vascularis, is essential to maintain an environment conducive to appropriate hair cell ...

La strie vasculaire a pour fonction de générer le potentiel endocochléaire et de réguler l’homéostasie ionique dans la cochlée. Le programme de développement et de restauration auditive cherche à comprendre les mécanismes sous-jacents reliant l’homéostasie ionique dysfonctionnelle aux troubles de l’audition et de la stabilité, qui sont des maladies où une fluctuation ou une perte auditive soudaine se produit. Les travaux dans mon laboratoire ont établi le paysage transcriptionnel de la strie vasculaire et ont contribué à notre compréhension de son importance dans l’audition.Nous avons utilisé ces données pour établir des parallèles avec des troubles de l’audition et de la stabilité mal compris, y compris la maladie de Ménière. Ce protocole permet la dissection et l’isolement de stria vascularis à montage entier pour d’autres études moléculaires, y compris l’immunohistochimie. Étant donné que les types de cellules vasculaires sont étroitement liés les uns aux autres, l’utilisation de l’isolement nucléaire et du séquençage de l’ARN mononucléaire a facilité notre compréhension de la machinerie transcriptionnelle distincte impliquée.

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Dissection of Adult Mouse Stria Vascularis for Single-Nucleus Sequencing or Immunostaining

1.3K vues.  National Institutes of Health. La strie vasculaire a pour fonction de générer le potentiel endocochléaire et de réguler l’homéostasie ionique dans la cochlée. Le programme de développement et de restauration auditive cherche à comprendre les mécanismes sous-jacents reliant l’homéostasie ionique dysfonctionnelle aux troubles de l’audition et de la stabilité, qui sont des maladies où une fluctuation ou une perte auditive soudaine se produit. Les travaux dans mon laboratoire ont établi le paysage transcript...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Dissection de stria vascularis de souris adultes pour le séquençage d’un seul noyau ou l’immunomarquage  

Endocochlear potential, which is generated by the stria vascularis, is essential to maintain an environment conducive to appropriate hair cell mechanotransduction and ultimately hearing. Pathologies of the stria vascularis can result in a decreased hearing. Dissection of the adult stria vascularis allows for focused single-nucleus capture and subsequent single-nucleus sequencing and immunostaining. These techniques are used to study stria vascularis pathophysiology at the single-cell level. 
Single-nucleus sequencing can be used in the setting of transcriptional analysis of the stria vascularis. Meanwhile, immunostaining continues to be useful in identifying specific populations of cells. Both methods require proper stria vascularis dissection as a prerequisite, which can prove to be technically challenging.

The stria vascularis is vital to the generation of endocochlear potential. Here, we present the dissection of the adult mouse stria vascularis for single-nucleus sequencing or immunostaining.

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Mouse Inner Ear Extraction and Stria Vascularis Dissection

To begin, identify the inner ear within the temporal bone of a euthanized mouse. Scrape away the cranial nerves using number 55 forceps. Then use number 55 forceps to dissect out the bulla and capsule, detaching them from surrounding bone.Remove any remaining soft tissue from the inner ear surface. For SV dissection, use number 55 forceps to hold the specimen by the vestibular portion with the cochlear facing up. Pierce through the cochlear bone at the apex using the same forceps.Scrape along the apical turn, applying gentle force to break away small pieces of the outer bone layer. Gently lift the bone and detach it from the lateral wall. Using number 55 forceps remove cochlear bone pieces from the apical and middle turns.Gently pushing down the lateral wall, pry and remove the bone wall pieces towards the middle turn to expose the lateral wall of the apical and middle turns. Push the apical turn lateral wall aside to expose the spiral ganglion. Detach the lateral wall of the apical and middle turns from the spiral ganglion along the outer hair cell layer.Then remove pieces of spiral ganglion from inside the cochlear. Detach the cochlear from the vestibular portion of the temporal bone by inserting the forceps into the round and oval window and pushing down towards the vestibule to have better access to the lateral wall of the basal turn. After the cochlear is detached remove the vestibular portion of the inner ear.Prioritize preserving as much of the strayer as possible. Continue removing til the bone of the middle turn is detached from the SV.Next, remove pieces of the remaining cochlear bone covering the basal turn. This can be accomplished by pushing the lateral wall layer under the bone to detach it.Pry and gently pull the tissue to remove the farthest basal part of the lateral wall being careful not to damage the soft tissue below. With the basal part of the lateral wall detached, separate the lateral wall from the remaining cochlear by tracing the forceps along the lateral wall. Gently brush the forceps between the bone and the remaining lateral wall until it reaches the apex.Then move the lateral wall to a fresh PBS. Lay the lateral wall flat revealing the SV as a darker layer of tissue on the internal side of the lateral wall. Gently pry the SV layer away from the lateral wall.Push aside the detached SV and advance the forceps along the lateral wall attempting to detach the SV as one long ribbon, trying not to squeeze the SV.Use a tissue scoop to collect the fragile tissue. Cochlear were dissected from adult mouse aged greater than or equal to postnatal day 30. Inner ear was extracted from the surrounding temporal bone.SV was exposed after the removal of bone covering the middle turn. The SV was fully separated from the lateral wall after dissection.

Extraction de l’oreille interne de souris et dissection vasculaire de Stria

Preparation of Stria Vascularis Single-Nucleus Suspension

Homogenize the dissected stria vascularis tissue from mouse ear in a two-milliliter Dounce homogenizer, with 10 to 20 strokes on ice. Lyse the tissue on ice for 25 minutes. Then, filter the tissue through a 30-micron filter and spin the filtrate at 500G for five minutes at four degrees Celsius.Remove the supernatant and resuspend the cell pellet in one milliliter of nuclei wash and resuspension buffer. Next, filter the cells through a 10-micron filter and centrifuge at 500G for five minutes at four degrees Celsius. Remove the supernatant and resuspend in 50 microliters of nuclei wash and resuspension buffer.After Trypan Blue staining, dilute five microliters of the cell suspension into 50 microliters of 1X PBS and count the cells. To prepare single nuclei captures, load the sample with the desired nuclear density onto the chip.

Préparation de la suspension mononucléaire de Stria Vascularis

Immunostaining of Mouse Stria Vascularis and Tissue Mounting

Prepare for immunostaining by dissecting the stria vascularis from the mouse and add the tissue to a 24-well plate containing 200 microliters of 4%paraformaldehyde in 1X PBS. Incubate the tissue for 20 minutes at room temperature. perform two short washes of 1X PBS on an orbital shaker at low RPM.Remove the PBS, then perform permeabilization and blocking for a minimum of one hour at room temperature in 300 microliters of PBST solution. Next, stain the tissue with the primary antibody overnight at four degrees Celsius. Then add a secondary antibody and incubate for two hours at room temperature on an orbital shaker at low RPM.Cover the plate to protect the fluorescently tagged secondary antibody from light. Next, prepare a larger microslide by placing two small streaks of glue along the 25 mm axis, just smaller than the 18 by 18 millimeter glass cover slip. Place one drop of mounting reagent between the glue streaks.Using number 55 forceps, gab as little tissue as possible on one end of the SV, and transfer it from PBS to the mounting reagent. Place one end of the cover slip on the slide where one streak of glue was placed. Then gently release the cover slip to avoid creating air bubbles.Seal the mount by dabbing a drop of transparent nail polish on each corner of the mount. Label the specimen on the glass cover slip, away from the visualization field. Visualize the SV tissue under a dissection microscope to ensure it is lying flat and not near any air bubbles.If the SV tissue is not oriented correctly, try to push out air bubbles or carefully remove the smaller glass cover slip and reposition the SV.A whole mount of SV from P30 mouse was prepared and confocal imaging was performed. ZsGreen expression was observed in the intermediate cells, GSIB4 labeled endothelial cells, and DAPI labeled the nuclei.