Notre méthode de dissection permet une isolation précise de la niche neurogène ventriculaire et est donc bien adaptée à l’étude du microenvironnement moléculaire de cette niche. Le principal avantage de cette méthode de dissection est qu’elle est précise, efficace et provoque une perturbation tissulaire minimale tout en restant compatible avec la spectrométrie de masse pour l’analyse du protéome. Dans ce protocole, nous extrayons la niche neurogène du ventricule d’un cerveau de souris, mais cette méthode peut également être appliquée à d’autres espèces et dans divers états de santé et de maladie.
La technique peut nécessiter une certaine formation. en particulier avec les coupes au scalpel lors de l’exposition et de l’extraction de la niche neurogène ventriculaire. Après avoir euthanasié une souris mâle C57 noire/6 âgée de 8 à 10 semaines, extrayez le cerveau par dissection manuelle et placez-le dans un plat de culture contenant un milieu de dissection glacé.
À l’aide d’un scalpel, retirez le bulbe olfactif en effectuant une coupe coronale droite entre le bulbe olfactif et le pôle intérieur du cortex. Ensuite, retirez le pôle antérieur du cortex en faisant une coupure coronale, en veillant à ce que les ventricules latéraux soient visibles dans le plan coronal. Ensuite, à l’aide de ciseaux, ouvrez les deux ventricules latéraux par le haut, en commençant par la section sagittale de la surface corticale à la lumière ventriculaire.
Allongez cette coupe en forme de C en suivant la flexion ventriculaire. Ensuite, connectez les extrémités caudales de l’incision sagittale gauche et droite, en utilisant une coupe coronale supplémentaire. Ensuite, retirez le cortex et le corps calleux recouvrant les parois ventriculaires médiales.
Si le tissu est attaché aux parois ventriculaires médiales, faites des coupures supplémentaires ou soulevez le cortex et le corps calleux avec des ciseaux pour déloger le tissu. Ensuite, à l’aide de pinces, retirez le cortex et le corps calleux recouvrant les ventricules latéraux. À l’aide d’une pince, étalez soigneusement les parois ventriculaires et retirez le plexus choroïde.
Ensuite, placez le cerveau sur une lame de verre et placez la glissière sur de la glace carbonique pour geler le cerveau avec les parois ventriculaires en configuration ouverte. Avant de sectionner, assurez-vous que le cerveau est attaché à la plaque d’attache du cryostat au niveau du cerveau postérieur avec un milieu d’intégration pour les tissus congelés. De plus, assurez-vous qu’aucun milieu d’intégration n’entre en contact avec le cerveau antérieur, en particulier au niveau des ventricules.
Ensuite, coupez des sections coronales du cerveau de 50 à 100 micromètres d’épaisseur jusqu’à l’extrémité du ventricule latéral et montez les sections sur les lames de verre. Placez les lames de verre sur de la glace carbonique sous un microscope à dissection. Soulevez les tranches de la glace carbonique pendant 15 à 30 secondes pour obtenir une décongélation brève et incomplète, rendant la myéline compacte du striatum observable sous forme de points blancs denses.
Ensuite, à l’aide d’un scalpel pré-refroidi, séparez la zone sous-épendymaire du striatum adjacent et transférez-la en morceau entier ou sectionnée en deux à quatre parties dans un tube de microcentrifugation à l’aide du bord émoussé du scalpel refroidi. Ensuite, faites de même pour la zone ventriculaire médiale. Des capsules internes du striatum associées à la myéline et à glycoprotéine positive ont été identifiées dans les échantillons de montage entier, mais rarement dans les échantillons de cryo-section-dissection par immunohistochimie.
La contamination striatale dans l’ensemble des échantillons a été confirmée par l’enrichissement des protéines de myéline dans la zone sous-épendymaire, par rapport aux échantillons de cortex somato-sensoriel. En revanche, les comparaisons de ces protéines marqueurs de la myéline dans les échantillons de cryo-section-dissection n’ont montré aucune différence significative dans la zone sous-épendymaire et les échantillons de cortex somato-sensoriel. En comparant les résultats de la spectrométrie de masse entre la cryo-section-dissection et la microdissection par capture laser, la microdissection par capture laser a donné environ deux fois moins de protéines quantifiées, bien que le temps de collecte des tissus ait été environ deux fois plus long.
L’analyse des composants principaux révèle qu’il existe une plus grande variabilité entre les échantillons prélevés avec la microdissection par capture laser, représentés sous forme de carrés, que parmi ceux collectés avec la cryo-section-dissection, représentés sous forme de cercles. Un test d’enrichissement par annotation 2D entre la dissection cryo-section et la microdissection par capture laser pour les zones épendymaires sous-épendymaires et médiales a révélé un enrichissement similaire dans les méthodes et les régions pour les protéines associées à l’espace extracellulaire. La cryo-section-dissection fournit une identification et une quantification plus robustes de la neurogenèse dans les protéines de matrice extracellulaire associées à la zone sous-épendymaire.
Dans le cas de la ténascine-C, seule la cryo-section-dissection a montré un enrichissement dans la zone sous-épendymaire par rapport à la zone épendymaire médiale. Assurez-vous que les sections du cerveau sur les diapositives ne deviennent pas complètement décongelées. Dans l’ensemble, il est bon de pratiquer les étapes de la procédure de dissection pour un résultat cohérent.
La méthode de dissection peut également être utilisée avec d’autres méthodes d’analyse des protéines qui peuvent facilement détecter des protéines très faibles en abondance, telles que les facteurs de croissance et les cytokines. Cette méthode de microdissection nous a permis d’identifier un nouveau régulateur de neurogenèse, et nous pensons qu’elle permettra à d’autres d’identifier d’autres régulateurs de la neurogenèse dans divers contextes.
