Nous tenons à remercier David Rodriguez pour son aide dans la préparation des figures et Precision Pathology Services (San Antonio, TX) pour l’utilisation de son cytomètre en flux Navios EX.

Toutes les procédures doivent être effectuées à l’aide d’un équipement de protection individuelle approprié.
1. Préparation de la solution mère du TCPP, 1,0 mg/mL
NOTE: Cela peut être préparé mensuellement.
<ol><li>À l’aide d’une balance analytique, d’une spatule et d’un papier de pesée, peser de 49,0 à 50,9 mg de RRCT. Arrondir le poids à 1/10 de milligramme. Mettez de côté la quantité mesurée de TCPP à l’abri de la lumière. REMARQUE: Utilisez un pistolet statique si la lecture du poids est instable.</li>
	<li>Déterminer les quantités requises d’eau purifiée et d’isopropanol (IPA) à partir du tableau 1 en fonction de la quantité de TCPP pesée à l’étape 1.1 . Ajouter l’eau purifiée et l’isopropanol à un bécher en verre de 100 ml et couvrir de parafilm pour protéger de l’évaporation.</li>
	<li>Déterminer la quantité requise de bicarbonate de sodium à partir du tableau 1 en fonction de la quantité de RRCT pesée à l’étape 1.1 .</li>
	<li>À l’aide de la balance analytique, de la spatule et du papier de pesée, peser la quantité requise de bicarbonate de sodium déterminée à l’étape 1.3. Arrondir le poids à 1/10 de milligramme. REMARQUE: Utilisez un pistolet statique si la lecture du poids est instable.</li>
	<li>Ajouter le bicarbonate de sodium dans le bécher de 100 mL contenant de l’eau purifiée et de l’isopropanol. Couvrir la solution avec du parafilm pour protéger de l’évaporation.</li>
	<li>Placer la solution de l’étape 1.5 sur une plaque d’agitation et remuer jusqu’à dissolution (environ 10 min)</li>
	<li>Mesurer le pH pour s’assurer que la solution contenant du bicarbonate de sodium de l’étape 1.6 a un pH compris entre 9 et 10.</li>
	<li>Ajouter lentement le TCPP pesé à l’étape 1.1 à la solution de l’étape 1.7 et continuer à agiter jusqu’à dissolution (~30 min). Protéger de la lumière pendant cette étape.</li>
	<li>Conserver dans un contenant en verre ou en polypropylène à température ambiante et à l’abri de la lumière.</li>
</ol>2. Préparation de l’acide 2-(N-morpholino)-éthanesulfonique (MES) et de la solution tampon de sel hémisodique, 0,1 M, pH 6,0-6,2 (« tampon MES »)
NOTE: Celui-ci doit être préparé le jour de l’utilisation et conservé à température ambiante.
<ol><li>Pesez 2,50 g de sel hémisodique MES et ajoutez-le dans une bouteille en plastique de 150 mL.</li>
	<li>Ajouter 121 mL d’eau purifiée et dissoudre par agitation manuelle jusqu’à ce qu’aucun solide ne soit visible.</li>
	<li>Mesurer le pH du tampon MES pour s’assurer qu’il se situe entre 6 et 6,2.</li>
	<li>Conserver à température ambiante pour une utilisation le jour même.</li>
</ol>3. N-(3-Diméthlyaminopropyl)-N'-éthylcarbodiimide (EDC) en poudre
<ol><li>Sortez la poudre EDC du congélateur et laissez-la reposer à température ambiante jusqu’à utilisation à l’étape 5.</li>
</ol>4. Combinaison de billes de polystyrène fonctionnalisées à l’amine avec une solution TCPP
<ol><li>Ajouter 4,3 mL de la solution tampon MES 0,1 M préparée à l’étape 2 dans un tube en polypropylène de 15 mL.</li>
	<li>Vortex la suspension de billes de polystyrène fonctionnalisée à l’amine (10 μm, 2,5 % p/v) pendant 60 s à vitesse maximale.</li>
	<li>Ajouter 288 μL de cette suspension de billes fraîchement vortex au tampon MES à partir de l’étape 4.1.</li>
	<li>Vortex la solution MES/bille pendant 15 s à vitesse maximale.</li>
	<li>Vortex la solution TCPP à 1 mg/mL préparée à l’étape 1 pendant 60 s à vitesse maximale.</li>
	<li>Ajouter 1,20 mL de cette solution mère TCPP fraîchement vortée à la suspension MES/talon de l’étape 4.4.</li>
	<li>Vortex la suspension MES/perle/TCPP pendant 15 s à la vitesse maximale.</li>
	<li>Couvrir le tube avec du papier d’aluminium pendant la préparation de la solution EDC.</li>
</ol>5. Préparation de solution mère d’hydrocholoride (HCl) de N-(3-diméthlyaminopropyl)-N'-éthylcarbodiimide (EDC)
REMARQUE : La solution EDC est périssable et doit être utilisée immédiatement après sa préparation.
<ol><li>Ajouter 20,0 mL d’eau purifiée dans un nouveau tube conique de 50 mL.</li>
	<li>Peser 200 mg de HCl EDC à partir de l’étape 3 et l’ajouter à l’eau (étape 5.1).</li>
	<li>Vortex l’EDC HCL pendant 15 s à vitesse maximale pour générer une solution claire.</li>
</ol>6. Préparation de la solution de travail HCl/MES d’EDC
REMARQUE : La solution HCl/MES d’EDC est périssable et doit être utilisée immédiatement après sa préparation.
<ol><li>Ajouter 54,0 mL de solution tampon MES (préparée à l’étape 2) dans une bouteille de plastique de 150 mL.</li>
	<li>Ajouter 6,0 mL de la solution mère de HCl EDC (préparée à l’étape 5) à la solution tampon MES et mélanger en agitant pendant 10 s.</li>
</ol>7. Étiquetage des billes avec le RRCT
<ol><li>Ajouter 4,5 mL de solution de travail EDC (à partir de l’étape 6) au tube en polypropylène de 15 ml contenant les billes et le TCPP dans le tampon MES (étape 4.7).</li>
	<li>Placer le tube dans un rotateur inverseur à 35 tr/min pendant 16 h à température ambiante et à l’abri de la lumière.</li>
	<li>Centrifuger le tube à température ambiante pendant 10 min à 1 000 × g.</li>
	<li>Aspirer le surnageant et remettre les billes en suspension dans 0,8 mL de solution saline équilibrée (HBSS) de Hanks.</li>
	<li>Transférer la solution de billes dans un flacon de polypropylène ambré à l’aide d’une pipette de 1 mL et conserver à 4 °C jusqu’à nouvelle utilisation. REMARQUE: Les perles sont stables pendant au moins 3 mois à ce stade.</li>
</ol>8. Contrôle de la qualité (CQ) des billes du RRCT par cytométrie en flux
REMARQUE : Le CQ devrait être axé sur la question de savoir si l’intensité médiane de fluorescence (ICM) des billes du TCPP est suffisamment brillante pour l’utilisation prévue et la quantité de particules générées par la procédure. Voir la section des résultats représentatifs pour plus de détails.
<ol><li>Étiquetez un tube en polystyrène de 5 ml comme « billes TCPP négatives ». REMARQUE: Les billes négatives sont différentes des perles fonctionnalisées aux amines utilisées pour l’étiquetage. Voir le tableau des matériaux.</li>
	<li>Étiquetez un autre tube comme « perles TCPP positives ».</li>
	<li>Étiquetez un autre tube comme « Perles arc-en-ciel ».</li>
	<li>Aliquote 300 μL d’HBSS glacé dans les tubes étiquetés avec « billes TCPP négatives » et « billes TCPP positives ».</li>
	<li>Ajoutez 500 μL de HBSS glacé dans le tube étiqueté « Perles arc-en-ciel ».</li>
	<li>Vortex brièvement la suspension de billes de polystyrène non fonctionnalisée (non étiquetée) à vitesse maximale (2-3 s) et ajoutez-en 10 μL dans le tube étiqueté « perles négatives TCPP ».</li>
	<li>Vortex la suspension de billes marquée TCPP (finalisée à l’étape 7.5) brièvement à la vitesse maximale, et ajoutez-en 3 μL dans le tube « Perles positives TCPP ».</li>
	<li>Faites un vortex de la suspension de perles arc-en-ciel brièvement à vitesse maximale et ajoutez-en deux gouttes dans le tube « Perles arc-en-ciel ».</li>
	<li>Gardez tous les tubes sur de la glace, couverts et protégés de la lumière.</li>
	<li>Initier les procédures de démarrage quotidiennes appropriées du cytomètre en flux et effectuer un contrôle qualité pour vérifier l’alignement optimal des fluides et du laser. NOTE: Pour cette partie du protocole, il est supposé que l’opérateur est formé à l’utilisation du cytomètre en flux disponible, y compris les procédures de normalisation de la diffusion de la lumière et de l’intensité de fluorescence, ainsi que les principes de base du calcul de la matrice de compensation correcte.</li>
	<li>Exécutez les perles Rainbow et les perles TCPP sans modifier les paramètres de tension entre les différentes exécutions.<ol><li>Courez et collectez 10 000 événements des perles arc-en-ciel.</li>
		<li>Effectuez un rinçage à l’eau et recueillez 10 000 occurrences de billes TCPP négatives.</li>
		<li>Effectuez un rinçage à l’eau et recueillez 10 000 occurrences de billes TCPP-positives.</li>
		<li>Effectuer un rinçage à l’eau de 1 min. REMARQUE : Il est important d’effectuer un rinçage à l’eau après avoir utilisé les billes du RRCT. Si le TCPP n’est pas rincé à partir des lignes du cytomètre, il est possible que le TCPP résiduel puisse marquer les cellules dans le tube suivant à acquérir.</li>
		<li>Effectuez les protocoles de nettoyage et d’arrêt appropriés spécifiques aux instructions du fabricant pour le cytomètre. REMARQUE : Pour des résultats représentatifs, voir la figure 1.</li>
	</ol></li>
</ol>9. Filtration des billes
REMARQUE : Si le CQ des billes par cytométrie en flux (étape 8) montre une forte proportion de particules (70 % ou plus), envisagez de filtrer la suspension du cordon en utilisant le protocole ci-dessous (Figure 2).
<ol><li>Ajouter 3,20 mL de HBSS glacé à 0,8 mL de la suspension de billes de TCPP finalisée à l’étape 7.5 (créant une dilution quintuple).</li>
	<li>Vortex la suspension de billes diluées à vitesse maximale pendant 15 s.</li>
	<li>Retirez le piston d’une seringue jetable de 5 mL.</li>
	<li>Installez la seringue avec un filtre à embout en fibre de verre (5 μm, 13 mm de diamètre).</li>
	<li>Ajouter 4 mL de HBSS à la seringue.</li>
	<li>Ajouter 0,5 mL de la suspension de billes diluées vortex (étape 9.2).</li>
	<li>Utilisez le piston pour filtrer la suspension à travers la seringue/filtre à environ 2 gouttes/s.</li>
	<li>Lavez les billes en aspirant 5 ml d’HBSS frais dans la seringue à travers le filtre à environ 2 gouttes/s.</li>
	<li>Poussez à nouveau le HBSS dans le conteneur à déchets à environ 2 gouttes/s.</li>
	<li>Pour retirer les billes du filtre, aspirez 5 ml supplémentaires d’HBSS frais dans la seringue à travers le filtre.</li>
	<li>Retirez délicatement le filtre de la seringue.</li>
	<li>Éjecter la suspension du cordon de la seringue dans un tube centrifuge conique de 50 mL.</li>
	<li>Replacez le filtre sur la seringue et répétez les étapes 9.10-9.12 quatre fois de plus. Jetez ensuite le filtre et la seringue.</li>
	<li>Répétez les étapes 9.2 à 9.13 jusqu’à ce que toutes les perles de l’étape 9.1 aient été filtrées. Utilisez une seringue neuve et filtrez à chaque fois.</li>
	<li>Centrifuger les suspensions filtrées de billes pendant 10 min à 1 000 × g à température ambiante.</li>
	<li>Aspirer le surnageant de chaque tube de 50 ml et remettre doucement les billes en suspension en les combinant dans 0,5 mL de HBSS frais.</li>
	<li>Transférer les billes à l’aide d’une micropipette p1 000 dans un nouveau flacon d’ambre, de verre ou de polypropylène et conserver à 4 °C.</li>
	<li>Répétez l’étape 8 pour déterminer si la proportion de particules liées au TCPP dans la suspension filtrée du cordon a diminué. Pour des résultats représentatifs, voir la figure 3.</li>
</ol>

Billes modifiées à la porphyrine en cytométrie en flux

<ol>
	<li>Josefsen, L. B., Boyle, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+diagnostic+and+therapeutic+roles+of+porphyrins+and+phthalocyanines+in+photodynamic+therapy,+imaging+and+theranostics.">Unique diagnostic and therapeutic roles of porphyrins and phthalocyanines in photodynamic therapy, imaging and theranostics.</a> Theranostics. 2 (9), 916-966 (2012).</li><li>Tsolekile, N., Nelana, S., Oluwafemi, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porphyrin+as+diagnostic+and+therapeutic+agent.">Porphyrin as diagnostic and therapeutic agent.</a> Molecules. 24 (14), 2669 (2019).</li><li>Gunaydin, G., Gedik, M. 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US7670799B2 - Method for making 5,10,15,10-tetrakis (carboxyphenyl) porphine (TCPP) solutions and composition compromising TCPP Available from: <a target="_blank" href="https://patents.google.com/patent/US7670799B2/en">https://patents.google.com/patent/US7670799B2/en</a> (2023)</li><li>Shimizu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+affinity+beads+for+identifying+drug+receptors.">High-performance affinity beads for identifying drug receptors.</a> Nature Biotechnology. 18 (8), 877-881 (2000).</li><li>Anderson, G. W., Zimmerman, J. E., Callahan, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+esters+of+N-hydroxysuccinimide+in+peptide+synthesis.">The use of esters of N-hydroxysuccinimide in peptide synthesis.</a> Journal of the American Chemical Society. 86 (9), 1839-1842 (1964).</li><li>Hermanson, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioconjugate Techniques. , (2013).</li><li>El-Faham, A., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+coupling+reagents,+more+than+a+letter+soup.">Peptide coupling reagents, more than a letter soup.</a> Chemical Reviews. 111 (11), 6557-6602 (2011).</li><li>Hulspas, R., O'Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+the+control+of+background+fluorescence+in+clinical+flow+cytometry.">Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry.</a> Cytometry Part B. 76 (6), 355-364 (2009).</li><li>Hoffman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization,+calibration,+and+control+in+flow+cytometry.">Standardization, calibration, and control in flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2005).</li><li>Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+porphyrin+chemistry+in+tumor+imaging+and+photodynamic+therapy.">The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy.</a> Chemical Society Reviews. 40 (1), 340-362 (2011).</li><li>Beharry, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+photodynamic+therapy:+New+probes+for+cancer+imaging+and+treatment.">Next-generation photodynamic therapy: New probes for cancer imaging and treatment.</a> Biochemistry. 57 (2), 173-174 (2018).</li><li>El-Far, M., Pimstone, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+28+porphyrins+and+their+abilities+to+localize+in+mammary+mouse+carcinoma:+Uroporphyrin+I+superior+to+hematoporphyrin+derivative.">A comparative study of 28 porphyrins and their abilities to localize in mammary mouse carcinoma: Uroporphyrin I superior to hematoporphyrin derivative.</a> Progress in Clinical and Biological Research. 170, 661-672 (1984).</li></ol>

Tous les auteurs sont des employés de bioAffinity Technologies.

Malgré les nombreuses applications des porphyrines dans le diagnostic et la thérapeutique du cancer2, il existe peu de littérature sur leur utilisation potentielle comme réactif cytométrique en flux pour l’identification des populations de cellules cancéreuses par rapport aux populations de cellules non cancéreuses dans les tissus humains primaires24,25,26. Nos recherches sur l’analyse cytomét...

Les porphyrines intéressent depuis de nombreuses années le domaine biomédical en raison de leur fluorescence et de leurs propriétés de ciblage tumoral 1,2,3. Les applications thérapeutiques telles que la thérapie photodynamique (PDT) et la thérapie sonodynamique (SDT) impliquent l’administration systémique d’une porphyrine à un patient cancéreux, l’accumulation du médicament dans la tumeur et l’exposition localisée de la tumeur à une lumière laser d’une longueur d’onde spécifique ou à des ultrasons. L’exposition à la lumière laser ou aux ultrasons conduit à la génération d’espèces réactives de l’oxygène par la porphyrine et à la mort cellulaire subséquente 4,5. Dans le diagnostic photodynamique (TED), la fluorescence de la porphyrine est utilisée pour distinguer les cellules cancéreuses des cellules normales6. Dans ce contexte, la protoporphyrine IX, une porphyrine fluorescente naturelle qui s’accumule dans les tumeurs lors de l’injection systémique ou locale de son précurseur, l’acide 5-aminolévulinique (5-ALA), est utilisée pour identifier les tumeurs stromales gastro-intestinales, le cancer de la vessie et le cancer du cerveau 7,8. Plus récemment, le traitement au 5-ALA a été exploré comme approche pour détecter une maladie résiduelle minimale dans le myélome multiple9. Notre laboratoire utilise la tétraarylporphyrine TCPP (5,10,15,20-tétrakis-(4-carboxyphényl)-21,23 H-porphine) pour sa capacité à colorer sélectivement les cellules cancéreuses du poumon et les cellules associées au cancer dans des échantillons d’expectorations humaines, une propriété qui a été exploitée dans les tests diagnostiques à base de lames et de cytométrie en flux10.
Certaines porphyrines sont bifonctionnelles en ce sens qu’elles peuvent être utilisées comme agents thérapeutiques et diagnostiques 2,11. Dans la recherche biomédicale, ces porphyrines bifonctionnelles sont utilisées pour évaluer comment leur capacité à cibler sélectivement et à tuer les cellules cancéreuses est fonction de leur structure ainsi que la façon dont elle est affectée par la présence d’autres composés 12,13,14,15,16. L’absorption cellulaire des porphyrines et leur cytotoxicité peuvent être mesurées sur une plate-forme cytométrique en flux de manière à haut débit. Les spectres d’absorption et d’émission des porphyrines fluorescentes sont complexes, mais la plupart des plateformes cytométriques en flux sont équipées pour les identifier correctement. Le spectre d’absorption des porphyrines fluorescentes est caractérisé par une forte bande d’absorption comprise entre 380 et 500 nm, connue sous le nom de bande Soret. Deux à quatre bandes d’absorption plus faibles sont généralement observées dans la gamme 500-750 nm (bandes Q)17. Un laser bleu de 488 nm, présent dans la plupart des cytomètres en flux, ou un laser violet (405 nm) peut générer une lumière de la longueur d’onde appropriée pour exciter les porphyrines. Les spectres d’émission des porphyrines affichent généralement des pics compris entre 600 et 800 nm18, ce qui entraîne très peu de chevauchement spectral avec l’isothiocyanate de fluorescéine ou les fluorophores de phycoérythrine (PE), mais un chevauchement considérable avec d’autres fluorophores souvent utilisés, tels que l’allophycocyanine (APC), ainsi que des fluorophores en tandem, tels que PE-Cy5 et autres. Par conséquent, lors de l’utilisation de porphyrines dans des essais de cytométrie en flux multicolore, les contrôles monofluorophores sont essentiels pour corriger adéquatement le débordement de la fluorescence dans des canaux autres que celui désigné pour mesurer la fluorescence de la porphyrine.
Idéalement, les témoins monofluorophores utilisés pour calculer la matrice de débordement pour un panel de fluorophores (également appelés « témoins de compensation ») devraient être constitués du même type de cellule que l’échantillon. Cependant, l’utilisation de l’échantillon à cette fin n’est pas optimale s’il y a très peu d’échantillon au départ ou si la population cible au sein de l’échantillon est très petite (par exemple, si l’on veut examiner une maladie résiduelle minimale ou des cellules cancéreuses aux premiers stades de la maladie). Une alternative utile aux cellules est les billes couplées avec le même fluorophore qui est utilisé pour analyser l’échantillon. Beaucoup de ces perles sont disponibles dans le commerce; Ces billes sont soit prémarquées avec le fluorophore désiré (billes spécifiques du fluorophore prémarquées)19,20, soit un anticorps marqué par fluorescence peut y être attaché (billes de capture d’anticorps)20,21. Bien que des billes de compensation commerciales soient disponibles pour de nombreux fluorophores, de telles billes ne sont pas disponibles pour les porphyrines, malgré leur utilisation croissante dans la recherche fondamentale et clinique.
En plus de la préservation des échantillons et des populations positives par rapport aux populations négatives de taille appropriée, les autres avantages de l’utilisation de billes comme contrôles compensatoires sont la facilité de préparation, la faible fluorescence de fond et l’excellente stabilité dans le temps22. L’inconvénient potentiel de l’utilisation de billes comme contrôle de compensation est que le spectre d’émission de l’anticorps fluorescent capturé sur les billes peut différer de celui du même anticorps utilisé pour marquer les cellules. Cela peut être d’une importance particulière lors de l’utilisation d’un cytomètre spectral20. Par conséquent, le développement de billes en tant que contrôle de compensation doit être effectué sur le cytomètre en flux qui sera utilisé pour le test pour lequel les billes sont développées. De plus, le développement des billes doit inclure une comparaison avec des cellules marquées avec le même réactif de coloration fluorescente.
Ici, nous décrivons la préparation de billes de compensation de polystyrène fonctionnalisées par amine TCPP, dont l’intensité médiane de fluorescence dans le canal de détection était comparable à celle des cellules marquées TCPP dans les expectorations, et leur utilisation comme contrôles de compensation pour la cytométrie en flux. L’autofluorescence des billes équivalentes non fonctionnalisées était suffisamment faible pour être utilisée comme témoins de compensation de fluorescence négative. De plus, ces billes ont démontré une stabilité en stockage pendant près de 1 an.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene</td>
			<td>Research Products International&#160;&#160;</td>
			<td>ZC1028-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 &#956;m diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>APX-100-10</td>
			<td>Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes, 50 mL, Falcon</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>with appropriate rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N&#39;- ethylcarbodiimide hydrochloride), &#8805;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>03450-1G</td>
			<td>CAS No:&#160; 25952-53-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1)</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips, 22 x 22 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-540-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 &#181;m, 13 mm diameter)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1190M60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol, ACS grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423830010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES (22- (N- mopholino)- N&#39;- ethanesulfonic acid, hemisodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0164</td>
			<td>CAS No:&#160; 117961-21-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Navios EX flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes, glass, 5.75&#34;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter (UB 10 Ultra Basic)</td>
			<td>Denver Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette controller (Drummond)</td>
			<td>Pipete.com</td>
			<td>DP101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Syringe, 5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO,&#160; 2.5% w/v, 8.0-12.9 &#181;m</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>PP-100-10&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tubes, 15mL, conical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene tubes, round bottom&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9207381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes, disposable - 10 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes, disposable - 25 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td>CAS No:&#160; 144-55-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine)&#160; Frontier Scientific&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-393-68</td>
			<td>CAS No:&#160; 14609-54-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Spark Plate Reader (or similar)</td>
			<td>Tecan Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube revolver/rotator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>88881001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

porphyrin-modified beads for use as compensation controls in flow cytometry

La cytométrie en flux peut rapidement caractériser et quantifier diverses populations cellulaires en fonction des mesures de fluorescence. Les cellules sont d’abord colorées avec un ou plusieurs réactifs fluorescents, chacun fonctionnalisé avec une molécule fluorescente différente (fluorophore) qui se lie sélectivement aux cellules en fonction de leurs caractéristiques phénotypiques, telles que l’expression de l’antigène de surface cellulaire. L’intensité de fluorescence de chaque réactif lié aux cellules peut être mesurée sur le cytomètre en flux à l’aide de canaux qui détectent une gamme spécifiée de longueurs d’onde. Lorsque plusieurs fluorophores sont utilisés, la lumière des fluorophores individuels déborde souvent dans des canaux de détection indésirables, ce qui nécessite une correction des données d’intensité de fluorescence dans un processus appelé compensation. 
Des particules de contrôle de compensation, généralement des billes de polymère liées à un seul fluorophore, sont nécessaires pour chaque fluorophore utilisé dans une expérience de marquage cellulaire. Les données des particules de compensation du cytomètre en flux sont utilisées pour appliquer une correction aux mesures d’intensité de fluorescence. Ce protocole décrit la préparation et la purification de billes de compensation de polystyrène fonctionnalisées par covalence avec le réactif fluorescent méso-tétra(4-carboxyphényl) porphine (TCPP) et leur application dans la compensation de cytométrie en flux. Dans ce travail, des billes de polystyrène fonctionnalisées à l’amine ont été traitées avec du TCPP et le réactif de couplage amide EDC (chlorhydrate de N-(3-diméthylaminopropyl)-N′-éthylcarbodiimide) à pH 6 et à température ambiante pendant 16 h avec agitation. Les billes TCPP ont été isolées par centrifugation et remises en suspension dans un tampon de pH 7 pour le stockage. Les particules liées au TCPP ont été observées comme sous-produit. Le nombre de ces particules pourrait être réduit à l’aide d’un protocole de filtration facultatif. Les billes TCPP résultantes ont été utilisées avec succès sur un cytomètre en flux pour la compensation dans des expériences avec des cellules d’expectorations humaines marquées avec plusieurs fluorophores. Les billes du RRCT se sont avérées stables après avoir été conservées au réfrigérateur pendant 300 jours.

Porphyrins have been of interest for many years in the biomedical field owing to their fluorescence and tumor-targeting properties1,2,3. Therapeutic applications such as photodynamic therapy (PDT) and sonodynamic therapy (SDT) entail the systemic administration of a porphyrin to a cancer patient, the accumulation of the drug in the tumor, and the localized exposure of the tumor to a laser light of a specific wavelength or ultrasound. The exposure to laser light or ultrasound leads to the generation of reactive oxygen species by the porphyrin and subsequent cell death4,5. In photodynamic diagnosis (PDD), porphyrin fluorescence is used to distinguish cancer cells from normal cells6. In this context, protoporphyrin IX, a natural fluorescent porphyrin that accumulates in tumors upon the systemic or local injection of its precursor, 5-aminolevulinic acid (5-ALA), is used to identify gastrointestinal stromal tumors, bladder cancer, and brain cancer7,8. More recently, 5-ALA treatment was explored as an approach to detect minimal residual disease in multiple myeloma9. Our laboratory has been using the tetraaryl porphyrin TCPP (5,10,15,20-tetrakis-(4-carboxyphenyl)-21,23H-porphine) for its ability to selectively stain lung cancer cells and cancer-associated cells in human sputum samples, which is a property that has been exploited in slide-based and flow cytometric diagnostic assays10.
Some porphyrins are bifunctional in that they can be used as therapeutic and diagnostic agents2,11. In biomedical research, such bifunctional porphyrins are used to evaluate how their ability to selectively target and kill cancer cells is a function of their structure as well as how it is affected by the presence of other compounds12,13,14,15,16. Both the cellular uptake of porphyrins and their cytotoxicity can be measured on a flow cytometric platform in a high-throughput manner. The absorption and emission spectra of fluorescent porphyrins are complex, but most flow cytometric platforms are equipped to correctly identify them. The absorption spectrum of fluorescent porphyrins is characterized by a strong absorption band in the 380-500 nm range, known as the Soret band. Two to four weaker absorption bands are generally observed in the 500-750 nm range (Q bands)17. A blue&#160;488 nm laser, present in most flow cytometers, or a violet laser (405 nm) can generate light of the appropriate wavelength to excite porphyrins. The emission spectra of porphyrins typically display peaks in the 600-800 nm range18, which results in very little spectral overlap with fluorescein isothiocyanate or phycoerythrin (PE) fluorophores but considerable overlap with other often-used fluorophores, such as allophycocyanin (APC), as well as tandem fluorophores, such as PE-Cy5 and others. Therefore, when using porphyrins in multi-color flow cytometry assays, single-fluorophore controls are essential to adequately correct the spillover of fluorescence in channels other than the one designated to measure the porphyrin&#39;s fluorescence.
Ideally, the single-fluorophore controls used to calculate the spillover matrix for a panel of fluorophores (also called &#34;compensation controls&#34;) should consist of the same cell type(s) as the sample. However, using the sample for this purpose is not optimal if there is very little sample to begin with or if the target population within the sample is very small&#160;(for example, if one wants to look at minimal residual disease or cancer cells at the early stages of the disease). A useful alternative to cells is beads coupled with the same fluorophore that is used to analyze the sample. Many such beads are commercially available; these beads are either prelabeled with the desired fluorophore (prelabeled fluorophore-specific beads)19,20, or a fluorescently labeled antibody can be attached to them (antibody capture beads)20,21. While commercial compensation beads are available for many fluorophores, such beads are unavailable for porphyrins, despite their increasing use in basic and clinical research.
In addition to sample preservation and appropriately sized positive versus negative populations, the other advantages of using beads as compensation controls are the ease of preparation, low background fluorescence, and excellent stability over time22. The potential disadvantage of using beads as a compensation control is that the emission spectrum of the fluorescent antibody captured on beads may differ from that of the same antibody used to label the cells. This may be of specific importance when using a spectral flow cytometer20. Therefore, the development of beads as a compensation control needs to be performed on the flow cytometer that will be used for the assay for which the beads are developed. Moreover, the development of the beads needs to include a comparison with cells labeled with the same fluorescent staining reagent.
Here, we describe the preparation of TCPP amine-functionalized polystyrene compensation beads, whose median fluorescence intensity in the detection channel was comparable to that of TCPP-labeled cells in sputum, and their use as compensation controls for flow cytometry. The autofluorescence of equivalent, non-functionalized beads was sufficiently low for their use as negative fluorescence compensation controls. In addition, these beads demonstrated stability in storage for nearly 1 year.

Pleins feux sur l’auteur : Billes modifiées à la porphyrine utilisées comme contrôles de compensation en cytométrie en flux  

Perles modifiées par la porphyrine utilisées comme témoins de compensation en cytométrie en flux

We developed polystyrene beads modified with the porphyrin TCPP as compensation controls and multicolor flow cytometry. The beads used in this protocol have fluorescence intensity comparable to TCPP stain cells and still passed through the flow cytometer. We accomplished that and are currently working on better methods to remove the particulate byproduct.Porphyrin-modified compensation beads were preferable to TCPP stained cells as compensation controls. These speeds were stable over months without significant loss of fluorescence. Porphyrins are known to stain cancer cells selectively.The research combines the selectivity of porphyrins with quantitative flow cytometry as a powerful platform for high-throughput analysis of human samples.

Ce protocole pour l’étiquetage TCPP des billes est relativement rapide et efficace. La figure 1 montre un résultat représentatif du processus d’étiquetage des billes du TCPP, déterminé par cytométrie en flux. La figure 1A montre le profil normalisé des perles arc-en-ciel, tel qu’il a été détecté dans le canal approprié pour détecter le TCPP. Ces billes servent de CQ pour la normalisation des tensions laser pour la détection du TCPP par le cy...

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Le protocole décrit comment les billes de compensation à base de porphyrine pour la cytométrie en flux sont préparées par la réaction de billes de polystyrène fonctionnalisées aux amines avec le TCPP de porphyrine et le réactif de couplage amide EDC. Une procédure de filtration est utilisée pour réduire les sous-produits particulaires.

Flow cytometry can rapidly characterize and quantify diverse cell populations based on fluorescence measurements. The cells are first stained with one or ...

Nous avons développé des billes de polystyrène modifiées avec le TCPP porphyrine comme contrôles de compensation et cytométrie en flux multicolore. Les billes utilisées dans ce protocole ont une intensité de fluorescence comparable à celle des cellules colorées TCPP et passent toujours à travers le cytomètre en flux. Nous y sommes parvenus et nous travaillons actuellement sur de meilleures méthodes pour éliminer le sous-produit particulaire.Les billes de compensation modifiées par la porphyrine étaient préférables aux cellules colorées TCPP comme témoins de compensation. Ces vitesses ont été stables pendant des mois sans perte significative de fluorescence. Les porphyrines sont connues pour colorer les cellules cancéreuses de manière sélective.La recherche combine la sélectivité des porphyrines avec la cytométrie quantitative en flux comme une plate-forme puissante pour l’analyse à haut débit d’échantillons humains.

porphyrin-modified-beads-for-use-as-compensation-controls-flow

Research

JoVE Journal

Chemistry

Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry

1.4K vues.  bioAffinity Technologies. Nous avons développé des billes de polystyrène modifiées avec le TCPP porphyrine comme contrôles de compensation et cytométrie en flux multicolore. Les billes utilisées dans ce protocole ont une intensité de fluorescence comparable à celle des cellules colorées TCPP et passent toujours à travers le cytomètre en flux. Nous y sommes parvenus et nous travaillons actuellement sur de meilleures méthodes pour éliminer le sous-produit particulaire.Les billes de compensation modi...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Billes modifiées à la porphyrine utilisées comme contrôles de compensation en cytométrie en flux  

Flow cytometry can rapidly characterize and quantify diverse cell populations based on fluorescence measurements. The cells are first stained with one or more fluorescent reagents, each functionalized with a different fluorescent molecule (fluorophore) that binds to cells selectively based on their phenotypic characteristics, such as cell surface antigen expression. The intensity of fluorescence from each reagent bound to cells can be measured on the flow cytometer using channels that detect a specified range of wavelengths. When multiple fluorophores are used, the light from individual fluorophores often spills over into undesired detection channels, which requires a correction to the fluorescence intensity data in a process called compensation. 
Compensation control particles, typically polymer beads bound to a single fluorophore, are needed for each fluorophore used in a cell labeling experiment. Data from compensation particles from the flow cytometer are used to apply a correction to the fluorescence intensity measurements. This protocol describes the preparation and purification of polystyrene compensation beads covalently functionalized with the fluorescent reagent meso-tetra(4-carboxyphenyl) porphine (TCPP) and their application in flow cytometry compensation. In this work, amine-functionalized polystyrene beads were treated with TCPP and the amide coupling reagent EDC (N-(3-dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride) at pH 6 and at room temperature for 16 h with agitation. The TCPP beads were isolated by centrifugation and resuspended in a pH 7 buffer for storage. TCPP-related particulates were observed as a byproduct. The number of these particulates could be reduced using an optional filtration protocol. The resultant TCPP beads were successfully used on a flow cytometer for compensation in experiments with human sputum cells labeled with multiple fluorophores. The TCPP beads proved stable following storage in a refrigerator for 300 days.

The protocol describes how porphyrin-based compensation beads for flow cytometry are prepared by the reaction of amine-functionalized polystyrene beads with the porphyrin TCPP and the amide coupling reagent EDC. A filtration procedure is used to reduce the particulate byproducts.

Recherche

Chimie

Preparation of Meso-Tetra(4-Carboxyphenyl) Porphine (TCPP) Stock Solution

To begin, weigh 49.0 to 50.9 milligrams of TCPP using an analytical balance. Round the weight to 1/10 of a milligram. Set the measured amount of TCPP aside, protected from light.Based on the amount of TCPP, add the required amounts of purified water and isopropanol to a 100 milliliter glass beaker and cover it with parafilm to protect it from evaporation. Next, weigh the required amount of sodium bicarbonate based on the amount of TCPP and add it to the 100 milliliter beaker containing purified water and isopropanol. Cover the solution with parafilm to protect it from evaporation, and place it on a stir plate for approximately 10 minutes.Once the contents are dissolved, ensure that the pH of the solution is between nine and 10. Next, carefully add the weighted TCPP, protect the solution from light, and stir it for approximately 30 minutes until dissolved. Store the solution in a polypropylene container at room temperature protected from light.

Préparation de la solution mère de méso-tétra(4-carboxyphényl) porphine (TCPP)

Combining Amine-Functionalized Polystyrene Beads with TCPP Solution

Begin by adding 4.3 milliliters of 0.1 molar MES buffer solution to a 15 milliliter polypropylene tube. Then add 288 microliters of the vortexed amine functionalized polystyrene bead suspension to the 15 milliliter polypropylene tube containing MES buffer. Vortex the MES bead solution for 15 seconds at maximum speed.Next, vortex the one milligram per milliliter TCPP solution for 60 seconds at maximum speed. Then add 1.2 milliliters of this solution to the MES bead suspension. After vortexing the resultant suspension for 15 seconds, cover the tube with foil.

Combinaison de billes de polystyrène fonctionnalisées à l’amine avec une solution TCPP

Labeling Amine-Functionalized Polystyrene Beads with TCPP

To begin, add freshly prepared 4.5 milliliters of EDC working solution to a 15 milliliter polypropylene tube containing the amine-functionalized polystyrene beads and TCPP in MES buffer. Place the tube in an inverting rotator at 35 RPM for 16 hours at room temperature protected from light. Then, centrifuge it for 10 minutes.Aspirate the supernatant and re-suspend the beads in 0.8 milliliters of Hank's Balanced Salt Solution. Then, using a one milliliter pipette, transfer the bead solution to an amber polypropylene vial and store it at four degrees Celsius. The relationship between the particulate formation, the median, fluorescence intensity or MFI, and the bead TCPP/EDC ratio showed that with increasing ratios, the MFI increased until it formed a plateau.The particulates appeared only when EDC was used as a coupling reagent during the labeling procedure. Labeling the beads with TCPP alone resulted in much lower fluorescence intensity. When TCPP-labeled beads were tested after 300 days, no significant change in the MFI or in the particulate content was observed.The coupling of TCPP to the beads had a minimum effect on its fluorescence emission spectrum. However, its spectrum differed more from TCPP-labeled A549 lung cancer cells. In a multi-flora four labeled sputum sample, the TCPP-labeled beads worked equally well as the TCPP-stained A549 cells.

Étiquetage des billes de polystyrène fonctionnalisées aux amines avec TCPP

Quality Check (QC) of the TCPP Beads by Flow Cytometry

Begin the quality check of the beads labeled as meso-tetra 4-carboxyphenyl porphine or TCPP beads in the flow cytometer by running and collecting 10, 000 events of the rainbow beads. Then perform a rinse with water and collect 10, 000 events of the TCPP negative beads. After rinsing with water again, collect 10, 000 events of the TCPP positive beads.Then perform a one minute water rinse before appropriate cleaning and shut down the flow cytometer. A representative outcome of the TCPP bead labeling process determined by flow cytometry is shown here with a standardized profile of rainbow beads. These beads serve as quality checks for standardizing the laser voltages to detect TCPP.The light scatter profile of amine functionalized polystyrene TCPP labeled beads was observed. The light scatter profile of non-functionalized beads was used as a negative bead control to calculate the compensation matrix. The population indicated by the red rectangle in the TCPP labeled beads was absent in the unlabeled bead suspension representing that the TCPP related particulates were not formed in the absence of TCPP and EDC.The fluorescence intensity of the labeled beads selected by the black gate was several logs higher than that of the unlabeled beads.

Contrôle de la qualité (CQ) des billes du RRCT par cytométrie en flux

TCPP Bead Filtration

Begin the TCPP bead filtration by diluting 0.8 milliliters of the TCPP bead suspension with 3.20 milliliters of ice-cold Hanks'Balanced Salt Solution, or HBSS. Vortex the diluted bead suspension at maximum speed for 15 seconds. Then, remove the plunger from a disposable five-milliliter syringe and fit the syringe with a five-micrometer glass fiber tip filter having a 13-millimeter diameter.Next, add four milliliters of HBSS to the syringe before adding 0.5 milliliters of the vortexed diluted bead suspension. Using the plunger, filter the bead suspension through the syringe filter at approximately two drops per second. Then, wash the beads by drawing five milliliters of fresh HBSS into the syringe through the filter and pushing the HBSS out into the waste container at approximately two drops per second.To remove the beads from the filter, draw another five milliliters of fresh HBSS into the syringe through the filter. Then, remove the filter carefully from the syringe. After ejecting the bead suspension from the syringe into a 50-milliliter conical centrifuge tube, place the fresh filter back on the syringe and repeat the five-milliliter HBSS wash four times.Once done, discard the filter and syringe. Centrifuge the filtered bead suspensions at room temperature for 10 minutes at 1, 000g. Aspirate the supernatant from each 50-milliliter tube.Gently resuspend the beads and 0.5 milliliters of fresh HBSS. Transfer the combined beads with a P1000 micropipette to a new amber-colored glass vial, and store at four degrees Celsius. The filtration effect on a bead suspension comprising approximately 66%particulates is seen here.After filtration, the particulate content decreased to approximately 25%The adverse effects of filtration are the loss of beads and a slight loss in fluorescence intensity.