Notre protocole est optimisé pour le modèle de souris et utilise des matériaux qui sont facilement accessibles à tous les chercheurs. Cette technique peut être appliquée à des modèles de souris sains, de maladie ou génétiquement modifiés. Notre protocole permettra aux chercheurs de répondre à toutes les questions sur la biologie péricyte cardiaque à partir de n’importe quel modèle de souris de la maladie ou de la variation génétique.
Cette procédure fournira un aperçu de la biologie péricyte cardiaque et nous aidera à comprendre leur contribution à l’homéostasie cardiaque et l’hémodynamique dans la santé et la maladie. Placez la souris anesthésiée dans la position supine, et tapez sur ses membres antérieurs. Ouvrez soigneusement la cavité thoracique et cannulez l’aorte descendante à l’aide d’une aiguille papillon de calibre 25.
Fais une entaille dans l’atrium droit. Puis, perfusez le cœur avec au moins 20 millilitres de 250 unités par millilitre héparinée, sans calcium-magnésium Saline tamponnée de Dulbecco à deux millilitres par minute avec une pompe périssaltique à débit variable. La perfusion est complète lorsque pbs propre sort de l’atria droite.
Coupez le cœur à l’aorte, et placez-le dans le DPBS glacé sans calcium-magnésium. Ensuite, transférez le cœur dans une boîte de Pétri de 15 par 15 centimètres. Couper le cœur en petits morceaux à l’aide de ciseaux à ressort et de forceps à pointe fine avec suffisamment de solution enzymatique pour couvrir les morceaux.
Maintenant, transférez les morceaux et la solution dans un tube conique de 50 millilitres, et scellez avec le film en plastique de paraffine. Incuber à 37 degrés Celsius sur un shaker orbital à 120 rpm pendant 75 minutes. Après la digestion du collagène avec la solution enzymatique, décanter le liquide à travers une passoire cellulaire de 100 microns dans un nouveau tube de 50 millilitres, laissant suffisamment de solution pour que les morceaux ne se dessèchent pas.
À l’aide de forceps à point fin, prendre le tissu du tube et placer quelques morceaux sur une lame de microscope. Ensuite, moudre le tissu entre deux diapositives de microscope pour briser le tissu. Rincez les diapositives avec des supports de culture sans enzymes dans un nouveau tube conique de 50 millilitres.
Répétez cette étape jusqu’à ce que tous les morceaux de tissu soient dissociés. Combinez la solution tendue et le tissu broyé en un seul tube. Filtrer la suspension résultante à travers une passoire cellulaire de 100 microns dans un nouveau tube conique de 50 millilitres.
Centrifuger l’échantillon à 220 fois g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Aspirez la solution précédente et résusquez doucement la pastille cellulaire dans un tampon de coloration FACS froid contenant du DPBS et de l’albumine de sérum bovin. Comptez les cellules et vérifiez la viabilité à l’aide d’un compteur cellulaire.
Diluer les cellules à un million de cellules par millilitre avec un tampon de coloration FACS froid contenant du DPBS et de l’albumine de sérum bovin. Les cellules sont maintenant prêtes à être tachées et triées. Préparer et étiqueter des tubes FACS de cinq millilitres pour tous les contrôles et les échantillons de cellules.
Aliquot un millilitre de cellules par tube pour un échantillon non taché, la fluorescence moins un contrôle, et les contrôles appariés à l’isotype. Utilisez les cellules restantes pour le tri. Tous les contrôles et échantillons peuvent être préparés et tachés en même temps.
En outre, préparer et étiqueter des tubes FACS de cinq millilitres pour un total de neuf contrôles de compensation, deux sortes de perles non tachées plus sept fluorochromes différents du panneau marqueur. Pour optimiser les contrôles de compensation de fluorescence, ajoutez une goutte de perles de compensation du flacon de compression à chaque tube. Ensuite, ajouter un microlitre d’anticorps aux perles.
Répétez l’opération pour chaque anticorps à partir du panneau marqueur. Utilisez les commandes FMO pour optimiser les taches de fond dues au chevauchement spectral. Pour les cellules dans les tubes de contrôle FMO, ajouter tous les anticorps du panneau marqueur à une dilution d’un à 100, mais exclure un anticorps.
Répétez l’opération pour chaque anticorps pour un total de sept contrôles. Utilisez des anticorps de contrôle appariés à l’isotype pour la coloration non spécifique. Aux cellules dans les tubes étiquetés isotype-assortis, ajoutez l’anticorps de commande isotype-assorti à une dilution d’un à 100.
Ensuite, préparez les cellules à trier. Pour les cellules fraîchement isolées, ajouter un cocktail d’anticorps à une dilution d’un à 100. En outre, ajoutez du colorant de viabilité cellulaire à une dilution d’un à 1000.
Mélanger vigoureusement les commandes de compensation par vortex d’impulsion. Incuber pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius, à l’abri de la lumière, à l’exception des perles de viabilité cellulaire, qui peuvent être laissées à température ambiante, à l’abri de la lumière. Mélanger délicatement les commandes fmo, les commandes appariées à l’isotype et les cellules à trier par vortex pulsé.
Incuber pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius, à l’abri de la lumière. Ajoutez trois millilitres de tampon de coloration FACS à chaque contrôle de compensation, contrôle fmo et contrôle de l’isotype. Centrifuger les tubes à 300 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
Aspirez la solution et réutilisez chaque granulé dans 400 microlitres de tampon de coloration FACS. Les contrôles de compensation, les contrôles fmo et les contrôles isotypes sont maintenant prêts à être utilisés. Après coloration, laver les cellules avec le tampon de coloration FACS par centrifugation à 300 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
Aspirez hors de la solution, et resuspendez la pastille cellulaire dans le tampon de coloration FACS à 0,5 million de cellules par millilitre. À l’aide de nouveaux tubes FACS qui ont des dessus de filtre de 35 microns, pipette les échantillons de cellules tachées sur les couvercles et le filtrate de gravité pour obtenir des suspensions à cellule unique. Restez sur la glace.
Utilisez un trieur cellulaire pour purifier les cellules. Exécutez les cellules non tachées sur le trieur de cellules pour régler les tensions et corriger le signal d’arrière-plan. Exécutez chaque échantillon de perle de compensation d’une seule couleur un à la fois pour ajuster des tensions pour chaque canal et ajuster des barrières pour le signal positif.
Recueillir les données. Utilisez le logiciel pour calculer le chevauchement spectral en calculant la matrice de compensation. Toutes les tensions sont prêtes et réglées.
Exécutez chaque contrôle isotype un à la fois. Ces données peuvent être utilisées pour ajuster les portes pour la liaison non spécifique s’il y en a. Exécutez chaque échantillon fmo un à la fois.
Réglez les tensions pour chaque canal pour corriger le saignement spectral dû à un panneau multicolore. Exécutez les échantillons de cellules tachées dans le trieur de cellules. Recueillir les cellules dans un média de culture sans enzymes de 10 millilitres dans un tube de collecte conique de 15 millilitres.
Utilisez la stratégie de gating suivante. Tout d’abord, porte pour les cellules individuelles. Puis, porte pour les cellules vivantes.
Ensuite, porte pour les cellules CD45 négatifs. Porte pour les cellules CD34 et CD31 négatives. Puis, porte pour les cellules NG2-positives.
Et enfin, porte pour les cellules CD146 et CD140b-positives. Pour la culture des péricytes, ensemencer les cellules fraîchement obtenues dans les médias de culture sans enzymes sur une plaque enduite de 24 puits. Culture des cellules dans un incubateur cellulaire fixé à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone, et 95% d’oxygène.
Après la digestion enzymatique et la dissociation de tout le cœur et avant la purification facs des cellules, les cellules sont un mélange brut qui contiennent de nombreux types de cellules différentes du cœur. Après la purification et la culture du FACS, les cellules sont homogènes. Ils sont nucléés simples, assez plats, et ont la morphologie rhomboïde péricyte typique.
À l’aide du FACS, les cellules sont purifiées à l’homogénéité. Premièrement, les débris et les doublets ont été fermés en fonction des distributions de dispersion vers l’avant et sur le côté. Ensuite, les cellules mortes ont été fermées en raison de leur réaction à l’amine avec le colorant, qui produit un signal plus grand et plus intense que les cellules vivantes.
Des cellules vivantes, les cellules hématopoïétiques ont été gated dehors en étant CD45-positif. Pour enlever davantage les cellules hématopoïétiques et endothéliales, des cellules CD34-positives et CD31-positives ont été gated dehors. Enfin, les cellules NG2-positives et CD140b/CD146-positives ont été sélectionnées pour être des cellules périivasculaires avec l’expression des marqueurs péricyte typiques.
Comparées aux péricytes humains de cerveau, les cellules ont eu une morphologie semblable. Comparées aux cellules lisses de souris et de muscle lisses humaines, les cellules ont eu une caractérisation phénotypique différente de morphologie des cellules au passage sept par immunocytochimie pour des marqueurs de péricyte n’ont montré aucun changement observé dans la morphologie ou l’expression de marqueur. De même, l’analyse par cytométrie de débit des péricytes au passage sept a confirmé que la population restait homogène.
La viabilité cellulaire est essentielle pour obtenir un bon rendement. Gardez les tissus au froid pendant l’approvisionnement et gardez les cellules froides pendant la coloration cellulaire. Assurez-vous également que la solution enzymatique est préparée fraîchement à chaque fois.
Pour assurer l’isolement des cellules correctes post-culturisme, caractérisez-les par la cytométrie de flux et la coloration immunofluorescente. Ces cellules peuvent être utilisées dans des expériences de coculture avec des cellules endothéliales pour des études de barrière fonctionnelle, ainsi que des analyses pour étudier leur fonction et leurs caractéristiques biologiques et physiologiques. Les péricytes cardiaques jouent un rôle fondamental dans l’intégrité et la stabilité vasculaires, et leur dysfonctionnement est conséquent à la fonction cardiaque globale.
Grâce à notre technique, les chercheurs peuvent explorer le potentiel thérapeutique des péricytes cardiaques.
