Nous tenons à remercier le laboratoire Mansky pour l’accès à l’équipement de congélation en plongée. Une partie de ces travaux a été réalisée dans l’installation de caractérisation de l’Université du Minnesota, qui reçoit un soutien partiel de la National Science Foundation (NSF) par l’intermédiaire du Materials Research Science and Engineering Center (MRSEC ; Numéro d’attribution DMR-2011401) et l’Initiative nationale sur les programmes d’études en neurosciences (NNCI ; Numéro d’attribution ECCS-2025124). Nous tenons à remercier le financement du Centre Comportement du VIH dans les environnements viraux (B-HIVE ; 1U54AI170855-01) et du Duke Center for HIV Structural Biology (DCHSB ; U54AI170752) centre.

1. Préparation de la grille
REMARQUE : Dans le plan expérimental, prévoir un maximum de 8 à 12 grilles au total par séance de congélation en plongée et de 4 à 5 grilles par puits. Plus que cela conduira à une très longue session de congélation en plongée, ce qui peut entraîner une augmentation du stress cellulaire, une contamination par la glace et des erreurs de l’utilisateur.
<ol><li>Décharge luminescente<ol><li>Charger un nombre approprié de grilles avec un film de support de carbone perforé à décharger à 15 mA pendant 45 s à 0,39 mBar d’atmosphère dans un dispositif de décharge luminescente.</li>
		<li>Assurez-vous que le côté carbone de la grille est orienté vers le haut. Lorsque vous avez terminé, transférez les grilles dans un récipient propre tapissé de papier filtre (Figure 1A1). REMARQUE : D’autres grilles peuvent être utilisées tant que le matériau n’est pas toxique pour les cellules (ce qui exclut toute grille en cuivre). Les grilles de recherche sont utiles pour les études corrélatives. Des grilles en d’autres matériaux sont également possibles. De nombreux laboratoires ont obtenu de bons résultats en cultivant des cellules au-dessus des grilles de support SiO2 8,9.</li>
	</ol></li>
	<li>Traitement adhérent<ol><li>Transférez les grilles, la fibronectine, le PBS, les plaques et la pince à épiler dans une enceinte de sécurité biologique. Traiter les deux côtés des grilles avec 20 μg/mL de fibronectine bovine en micropipetant deux points de solution adhérente de taille généreuse sur une surface stérile, comme le couvercle d’une plaque à 6 puits. Assurez-vous que les points sont suffisamment grands pour envelopper toute la grille (environ 100 μL est recommandé). REMARQUE : Avant le traitement avec la solution adhérente sélectionnée, il est possible de photo-micromodeler la grille ici pour optimiser la fixation des cellules au centre des carrés de la grille. La réduction de la capacité des cellules à s’attacher aux barres augmentera le nombre de cellules imageables. C’est idéal pour les expériences impliquant le fraisage cryoFIB.</li>
		<li>Utilisez une pince à épiler 5/15 pour manipuler les grilles. Assurez-vous de traiter les deux côtés de la grille en solution. REMARQUE : D’autres solutions adhésives peuvent être utilisées (fibrinogène, collagène, autres composants de la matrice extracellulaire, etc.). La fibronectine est utilisée ici, car elle donne de bons résultats avec une grande variété de lignées cellulaires. (U2OS, HeLa, Vero, Calu-3, Tzm-bl). La pince à épiler 5/15 est utile car sa géométrie permet une meilleure maniabilité autour des plaques à 6 puits, des paraboles de 35 mm et des micro-lames. Il en résulte moins de contraintes mécaniques sur les grilles et un film de carbone plus intact. Assurez-vous que tous les matériaux requis sont placés dans l’enceinte de sécurité biologique avant de commencer, car cela réduit le risque de contamination du réseau.</li>
	</ol></li>
	<li>Fixation de grilles<ol><li>Une fois traitée avec de la fibronectine bovine, la grille deviendra collante. À l’aide d’une pince à épiler 5/15, touchez doucement la surface non carbonée de la grille au fond d’un plat ou d’une assiette vide et ouvrez la pince à épiler. La grille doit se fixer facilement à la nouvelle surface (Figure 1A2). REMARQUE : Essayez d’éviter de placer des grilles au centre direct ou sur les bords du plat / de l’assiette. Lors de l’ajout de cellules, la densité cellulaire a tendance à s’accumuler au centre de la plaque. Cela peut entraîner des grilles avec une densité cellulaire excessive. Alternativement, des supports de grille imprimés en 3D peuvent être utilisés ici au lieu de fixer des cellules directement à la surface du plat/de l’assiette12.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubation<ol><li>Incuber les grilles pendant 30 min dans la solution adhérente à la fibronectine (20 μg/mL). Pour s’assurer que les grilles ne deviennent pas sèches pendant ce processus, micropipeter 1 à 2 gouttes de solution plus adhérente directement sur les grilles toutes les 15 minutes (Figure 1A3). REMARQUE : La période d’incubation variera en fonction de la solution adhérente utilisée. Pour la fibronectine bovine, le temps recommandé est de 30 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Lavage<ol><li>Après la période d’incubation, éliminer l’excès de solution adhérente par micropipetage. Lavez les grilles en micropipetant des gouttes de PBS directement sur les grilles. Répétez cette opération 2-3 fois. (Figure 1A4).</li>
	</ol></li>
	<li>Stérilisation<ol><li>Utilisez la lumière UV pour stériliser les grilles de l’enceinte de sécurité biologique pendant 1 h. Placez les grilles le plus près possible de la source d’UV pour maximiser la stérilisation (figure 1A5). Pour vous assurer que les grilles ne deviennent pas sèches pendant ce processus, micropipetez 1 à 2 gouttes de PBS directement sur les grilles toutes les 10 minutes. REMARQUE : Les étapes 1.4 à 1.6 peuvent être effectuées simultanément.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Grilles de semis
<ol><li>Compter les cellules :<ol><li>Détacher et compter les cellules à l’aide de méthodes mécaniques ou enzymatiques. Déterminez le nombre optimal de cellules à utiliser pour l’ensemencement avant le comptage. Pour U2OS ensemencé dans une plaque à 6 puits, utilisez entre 6 x 104 et 1,6 x 105 cellules par puits (Figure 1B1). REMARQUE : Le nombre de cellules ensemencées varie en fonction du type de cellule, de la surface du puits, de la boîte ou de la microlame utilisée, du temps écoulé entre l’ensemencement et la congélation en plongée et du plan expérimental. Testez une plage de numéros de cellules pour identifier les conditions qui se traduiront par 0,25 à 1 cellule par carré de grille au moment de la congélation en plongée. Il est important de noter qu’une densité cellulaire élevée réduit la vitesse de transfert de chaleur et peut avoir un impact sur le processus de vitrification. Pour lutter contre cela, certains laboratoires ont réussi à utiliser des tamis cellulaires, qui agissent pour empêcher la formation d’amas cellulaires13. Enfin, ce protocole aboutit à la fixation aléatoire des cellules à la couche de carbone. Si une fixation ciblée est nécessaire, un photo-micromotif peut être utilisé (voir étape 1.3)14.</li>
	</ol></li>
	<li>Ajout de cellules et de milieu de culture : Ajouter des cellules à l’aide d’une micropipette dans les puits, en évitant les bulles (Figure 1B2). Dans une plaque à 6 puits, un volume total de puits de 1,5 à 2,0 ml est recommandé. REMARQUE : Il est recommandé de mouiller soigneusement autour des grilles avant d’ajouter tout le volume. Cela aidera à empêcher les grilles de se détacher et de flotter dans la solution. Déplacez doucement la plaque d’un côté à l’autre pour faciliter la distribution homogène des cellules sur le puits. Ne faites pas tourner la plaque dans un mouvement circulaire, car cela entraînerait une densité cellulaire excessive au centre du puits.</li>
	<li>Incubation : Incuber les lames à 37 °C pendant un temps approprié selon le plan expérimental, qui dépendra des applications en aval. Dans cet exemple (transfection de clones moléculaires du VIH), incuber entre 16 et 24 h (Figure 1B3). REMARQUE : Des temps d’incubation plus longs entraîneront plus de cycles de division cellulaire. Par conséquent, ajustez le nombre de cellules de départ pour l’ensemencement en conséquence.</li>
</ol>3. Transfection
<ol><li>Préparation du mélange de transfection :<ol><li>Préparez un réactif liposomique cationique approprié pour la transfection plasmidique dans la lignée cellulaire sélectionnée.</li>
		<li>Dans cet exemple de transfection, utilisez 1 μg d’ADN plasmidique total par puits (dans une plaque à 6 puits) à transfecter dans un rapport de 1 :3 entre le plasmide HIViΔEnv et le plasmide psPAX2. Pour chaque puits, diluer 1 μg d’ADN dans 50 μL de DMEM sans sérum. Homogénéiser le mélange par micropipetage répété ou par un léger tourbillonnement de la plaque.</li>
		<li>Pour chaque puits, diluer 3 μL de réactif de transfection dans du DMEM sans sérum, puis homogénéiser à nouveau le mélange par micropipetage ou tourbillonnage doux. Ajouter l’ensemble du mélange de réactifs de transfection dilué au mélange d’ADN dilué (étape 3.1.2) et incuber à température ambiante (RT) pendant 15 min (Figure 1C1). REMARQUE : Pendant l’incubation de ce mélange, remplacez le milieu dans les puits par 1,5 mL de DMEM frais. Attention à ne pas déloger les grilles du fond du puits.</li>
	</ol></li>
	<li>Pour appliquer le mélange de transfection, pipeter 100 μL du mélange de l’étape 3.1.3 goutte à goutte dans chaque puits, en concentrant les gouttes sur les grilles pour assurer le contact (figure 1C2). Changez le milieu de culture 16 à 24 h après la transfection (Figure 1C3).</li>
</ol>4. Congélation en plongée
REMARQUE : Conservez les cellules à 37 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin pour le transfert. De plus, assurez-vous de noter le côté carbone des grilles tout au long du processus.
<ol><li>Densité cellulaire<ol><li>Vérifiez les grilles dans un microscope optique inversé et notez les densités de cellules sur chaque grille. REMARQUE : Les grilles de moins de 0,25 cellule par carré de grille (ou une cellule toutes les 4 cases de grille) sont considérées comme « vides ». Les grilles de 0,25 à 1 cellule par carré de grille sont considérées comme « normales ». Les grilles de plus de 1 cellule par carré de grille sont considérées comme « pleines ».</li>
		<li>Prenez note de la densité de cellules sur chaque grille pour permettre la numérotation des temps de transfert plus tard pendant la congélation en plongée. Ajouter 2 à 3 mL de PBS dans une assiette ou un plat vide et chauffer à 37 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation des repères<ol><li>Pour préparer les repères d’or pour les applications de cryotomographie en aval, pipeter 50 μL de solution de billes d’or colloïdal de 10 nm dans un tube propre de 1,5 mL. Ajouter 2 μL de BSA à 1 mg/mL dans le tube et homogénéiser par micropipetage répété.</li>
		<li>Centrifuger le tube à 15 000-20 000 x g pendant 15 min. Micropipette pour éliminer le plus possible le surnageant sans perturber la pastille. REMARQUE : Le granulé sera très lâche.</li>
		<li>Ajouter 50 μL de PBS à la pastille et remettre en suspension. Centrifugez à nouveau le tube à 15 000-20 000 x g pendant 15 min.</li>
		<li>À l’aide d’un embout de 10 μL, aspirez directement 4 μL de la pastille et transférez-la dans un tube propre de 1,5 mL (Figure 1D1). Utilisez 1 μL d’or lavé et concentré par grille. REMARQUE : Le type de repères utilisés dépend des applications en aval. Pour la tomographie MET, utilisez des billes d’or de 10 nm. Pour la tomographie à rayons X mous, utilisez des billes d’or de 200 nm. Pour la microscopie de corrélation, utilisez des billes de latex fluorescentes. Les repères ne sont normalement pas nécessaires pour les expériences impliquant le broyage cryoFIB, car le processus de broyage les détruirait.</li>
	</ol></li>
	<li>Buvard<ol><li>Réglez la chambre climatique à 95 % d’humidité et à 30 °C (Figure 1D1). Sélectionnez une grille à l’aide de la pince à épiler 5/15.</li>
		<li>Lavez les grilles avec du PBS et transférez-les dans une pince à épiler plongeante (Figure 1D2). Une fois fixé, retirez la pince à épiler 5/15 et faites glisser la pince sur la pince à épiler plongeante.</li>
		<li>Insérez la grille dans le congélateur plongeant en maintenant la pince bien fixée (Figure 1D3). Ajouter 1 μL de repères en or à l’arrière de la grille (figure 1D4). Ajoutez 2 à 3 μL de PBS du côté carbone de la grille. Utilisez le transfert automatisé pour éponger la face arrière de la grille et plonger le congélateur dans de l’éthane liquide (figure 1D5). REMARQUE : Il est recommandé d’avoir entre 3 et 4 μL de volume par grille pour un buvard optimal. Les grilles peuvent retenir une quantité variable de PBS après le lavage. Ajustez le volume supplémentaire de PBS pour tenir compte de la rétention de liquide préexistante sur le réseau. Il est recommandé d’ajouter les repères d’or à l’arrière de la grille. L’ajout à l’avant peut entraîner des flaques de repères d’or près du point d’insertion, tandis que l’ajout à l’arrière donne une solution plus homogénéisée. La durée du transfert dépend de la dentisterie cellulaire de la grille. 2 s pour vide, 3 s pour normal et 4 s pour les grilles pleines, respectivement. Le type de congélateur plongeant disponible peut déterminer la façon dont le transfert est abordé : le congélateur plongeant Leica GP2 est celui utilisé dans ce protocole et est capable d’automatiser le transfert unilatéral par défaut. Thermo Fisher Vitrobot effectue un transfert double face automatisé, bien que cela endommage souvent les cellules attachées au côté carbone. Il est également possible d’effectuer un transfert manuel dans le Vitrobot, ainsi que des pistons manuels à gravité.</li>
	</ol></li>
</ol>

Préparation de grilles de microscopie électronique pour la cryotomographie cellulaire in situ

<ol>
	<li>Zhang, P., Mendon&#231;a, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Viruses+in+the+Cellular+Context+by+Electron+Tomography.">Analysis of Viruses in the Cellular Context by Electron Tomography.</a> Encyclopedia of Virology. 1, 242-247 (2021).</li><li>F&#228;&#223;ler, F., Dimchev, G., Hodirnau, V. -. V., Wan, W., Schur, F. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography+structure+of+Arp2/3+complex+in+cells+reveals+new+insights+into+the+branch+junction.">Cryo-electron tomography structure of Arp2/3 complex in cells reveals new insights into the branch junction.</a> Nature Communications. 11, 6437 (2020).</li><li>McDowall, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+frozen+hydrated+sections+of+vitreous+ice+and+vitrified+biological+samples.">Electron microscopy of frozen hydrated sections of vitreous ice and vitrified biological samples.</a> Journal of Microscopy. 131 (Pt 1), 1-9 (1983).</li><li>Stewart, M., Vigers, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+frozen-hydrated+biological+material.">Electron microscopy of frozen-hydrated biological material.</a> Nature. 319 (6055), 631-636 (1986).</li><li>Gan, L., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+tomography+of+cells.">Electron tomography of cells.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 45 (1), 27-56 (2012).</li><li>Yang, J. E., Larson, M. R., Sibert, B. S., Shrum, S., Wright, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CorRelator:+Interactive+software+for+real-time+high+precision+cryo-correlative+light+and+electron+microscopy.">CorRelator: Interactive software for real-time high precision cryo-correlative light and electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 213 (2), 107709 (2021).</li><li>Mendon&#231;a, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+multi-scale+cryo-imaging+unveils+SARS-CoV-2+assembly+and+egress.">Correlative multi-scale cryo-imaging unveils SARS-CoV-2 assembly and egress.</a> Nature Communications. 12 (1), 4629 (2021).</li><li>Klumpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+platform+for+automated+cryo-FIB+workflows.">A modular platform for automated cryo-FIB workflows.</a> eLife. 10, e70506 (2021).</li><li>Wagner, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+samples+from+whole+cells+using+focused-ion-beam+milling+for+cryo-electron+tomography.">Preparing samples from whole cells using focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography.</a> Nature Protocols. 15 (6), 2041-2070 (2020).</li><li>Klein, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFITM3+blocks+influenza+virus+entry+by+sorting+lipids+and+stabilizing+hemifusion.">IFITM3 blocks influenza virus entry by sorting lipids and stabilizing hemifusion.</a> Cell Host &amp; Microbe. 31 (4), 616.e20-633.e20 (2023).</li><li>Shah, P. N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+rotavirus+assembly+pathway+in+situ+using+cryoelectron+tomography.">Characterization of the rotavirus assembly pathway in situ using cryoelectron tomography.</a> Cell Host &amp; Microbe. 31 (4), 604.e4-615.e4 (2023).</li><li>F&#228;&#223;ler, F., Zens, B., Hauschild, R., Schur, F. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printed+cell+culture+grid+holders+for+improved+cellular+specimen+preparation+in+cryo-electron+microscopy.">3D printed cell culture grid holders for improved cellular specimen preparation in cryo-electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 212 (3), 107633 (2020).</li><li>Hoffmann, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryo-tomography+reveals+the+subcellular+architecture+of+growing+axons+in+human+brain+organoids.">Electron cryo-tomography reveals the subcellular architecture of growing axons in human brain organoids.</a> eLife. 10, e70269 (2021).</li><li>Toro-Nahuelpan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+cryo-electron+microscopy+grids+by+photo-micropatterning+for+in-cell+structural+studies.">Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies.</a> Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).</li></ol>

Les auteurs ne déclarent pas d’intérêts concurrents.

Ici, nous avons fourni un protocole accessible, flexible et reproductible pour ensemencer des cellules sur des grilles de microscopie électronique pour des applications de tomographie cryoélectronique in situ . Cette méthode peut être facilement adaptée pour répondre aux besoins des applications en aval et/ou aux exigences expérimentales. En plus d’une grande flexibilité, nous avons décrit un flux de travail qui optimise et réduit les pièges courants de l’ensemencement en grille, notamment les dommages importants à la couche de carbone, la faible densité cellulaire et la mauvaise intégrité structurelle des projections de cellules minces.
Bien que le protocole décrit ici offre plusieurs alternatives, certaines étapes critiques doivent être suivies pour optimiser les résultats généraux. L’un des plus gros problèmes liés à l’ensemencement des cellules de grille est le détachement et le flottement des grilles du puits ou de la microlame. Par conséquent, il est important de mouiller complètement la grille avec une solution adhérente des deux côtés et d’éviter qu’elle ne sèche pendant la période d’incubation. Si vous utilisez des supports de grille imprimés en 3D, sachez que plusieurs changements de support sur ces supports ont le potentiel de produire des grilles flottantes, car l’air emprisonné sous la grille peut le forcer à sortir du support. 
Notre choix de pince à épiler améliore également la qualité de la grille en fournissant un moyen géométriquement favorable de manipuler les grilles sans plier considérablement la grille qui endommagerait la couche de carbone. Maintenir les cellules à 37 °C le plus longtemps possible avant de plonger réduit la souffrance cellulaire et améliore le nombre de cellules minces imageables sur la grille. Enfin, le transfert du côté de l’or protégera les cellules des forces mécaniques sévères qui pourraient endommager les structures cellulaires fragiles.
Bien qu’elle ne soit pas incluse dans ce protocole, il a été démontré que le photo-micropatterning de grille augmente le nombre de cellules imageables en optimisant leur fixation au centre des carrés de la grille14. Enfin, les supports de grille imprimés en 3D ont récemment été utilisés pour réduire les dommages causés à la grille en limitant la manipulation directe de la grille12.
Il peut être important de noter que ce protocole est optimisé pour l’imagerie des bords minces et des protubérances des cellules pour l’application de la cryotomographie. Nous vous suggérons de résoudre une variété de conditions à partir de nos recommandations dans le protocole afin de trouver le meilleur résultat pour les applications en aval de votre choix. Dans l’ensemble, ce protocole fournit une méthode fiable et polyvalente d’ensemencement de cellules sur des grilles qui peuvent être ajustées pour des besoins spécifiques.

La cryotomographie cellulaire in situ est une technique puissante permettant d’étudier des structures biologiquement pertinentes dans les cellules sans fixation chimique. En attachant les cellules à des grilles EM et en les congelant en plongée dans un cryogène, les objets d’intérêt sont congelés dans leurs contextes cellulaires naturels sans formation de glace cristalline à partir d’eau intracellulaire 1,2. La fixation chimique et la formation de glace cristalline peuvent perturber les structures de molécules pertinentes, telles que les protéines et les lipides, réduisant ainsi la précision biologique des images obtenues à l’aide de ces techniques 3,4. En tomographie, les grilles sont imagées à des angles incrémentiels à l’aide de la microscopie électronique, et ces images sont ensuite utilisées pour construire des représentations tridimensionnelles de la région cible imagée5. La cryotomographie in situ peut être utilisée parallèlement à d’autres techniques de microscopie pour l’imagerie intégrative et corrélative, telles que l’imagerie par cryofluorescence, la tomographie à rayons X mous et la cryoFIB/SEM (cryogenic Focused Ion Beam/Scanning Electron Microscopy)6,7,8,9,10,11 . L’intégration de plusieurs techniques permet d’obtenir plus d’informations sur une structure ou un processus qu’une seule technique de microscopie ne pourrait le faire.
Malgré tous les avantages de la cryotomographie cellulaire in situ , la préparation des échantillons peut s’avérer difficile pour diverses raisons. En raison de leur fragilité, la manipulation forcée des grilles de microscopie électronique peut entraîner des dommages, la fine couche de carbone en particulier étant délicate et sujette à la déchirure, réduisant ainsi la surface imageable des grilles. Les grilles de microscopie électronique sont également difficiles à manipuler en raison de leur petite taille et ont tendance à se détacher de la surface des puits ou des microlames utilisés pour faire pousser des cellules. La manipulation des grilles à l’intérieur des puits ou des microlames peut s’avérer difficile en raison de la géométrie de celles-ci. Une mauvaise préparation des grilles (par exemple, les laisser flotter) peut entraîner une faible densité cellulaire et réduire le nombre de zones d’imagerie potentielles, en particulier lorsque les cellules ne sont pas susceptibles de se fixer aux grilles elles-mêmes. Pour la cryotomographie cellulaire directe, les cellules doivent s’étaler très finement, ce qui peut être perturbé pour de nombreuses raisons, notamment des températures inadéquates ou une manipulation brutale des grilles.
Grâce à une variété d’optimisations, les techniques présentées dans cet article sont destinées à gérer les pièges les plus courants qui surviennent lors de la préparation des grilles de microscopie électronique pour la cryotomographie. L’utilisation d’une pince à épiler coudée 5/15 permet la manipulation de grilles à l’intérieur de plaques de puits ou de microlames. Une solution de fibronectine appliquée des deux côtés des grilles avant le placage rend les grilles flottantes moins probables, ce qui est bénéfique pour s’assurer que les grilles ont une densité cellulaire adéquate et que les grilles sont moins susceptibles d’être endommagées en raison de la manipulation. En maintenant les grilles incubées à 37°C jusqu’à la surgélation en plongée, nous veillons également à ce que les cellules soient maintenues dans un environnement confortable pour éviter que les cellules ne rétractent leurs bords fins. Le fait de masquer les grilles à l’arrière permet également d’éviter d’endommager les cellules sous l’effet d’une force mécanique. L’ensemble de ces mesures augmente le taux de réussite de la préparation des échantillons pour les études de cryotomographie cellulaire in situ , augmentant ainsi l’accessibilité de cette approche d’imagerie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 nm colloidal gold bead solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>741957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well multidish, 100/CS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra V-15R Benchtop Centrifuge, IVD 120 V 60 Hz</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>C63125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Au G300F1 with R2/2 Quantifoil carbon</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>TEM-G300F1-AU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND&#160;counting chamber BLAUBRAND&#160;Neubauer improved</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR717805-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMi1 Inverted Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>22A00G119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle&#39;s medium - high glucose, no glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 5/15 tweezer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>0103-5/15-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM GP2</td>
			<td>Leica</td>
			<td>587085</td>
			<td>Automated plunge freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A5209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from bovine plasma, cell culture grade</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenJet version II in vitro DNA transfection reagent</td>
			<td>SignaGen Laboratories</td>
			<td>SL100489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX I 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neslab EX-211 Heating Circulator</td>
			<td>Neslab</td>
			<td>Out of production</td>
			<td>Water bath for media warming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Original Portable Pipet-Aid Pipette Controller</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>4-000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pelco easyGlow device</td>
			<td>Pelco</td>
			<td>91000S</td>
			<td>Glow discharge device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P1000, 100&#8211;1000 &#181;L, Metal Ejector</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144059M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, 0.2&#8211;2 &#181;L, Metal Ejector</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144054M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P20, 2&#8211;20 &#181;L, Metal Ejector</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144056M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman number 2 filter paper, 55 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>28455-041</td>
			<td>Blotting paper</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for in situ cryotomography of mammalian cells

La cryotomographie cellulaire in situ est une technique puissante pour étudier des objets complexes dans leur contexte cellulaire natif congelé-hydraté, ce qui la rend très pertinente pour la biologie cellulaire et la virologie. Le potentiel de combiner la cryotomographie avec d’autres modalités de microscopie en fait une technique parfaite pour l’imagerie intégrative et corrélative. Cependant, la préparation des échantillons pour la tomographie cellulaire in situ n’est pas simple, car les cellules ne se fixent pas facilement et ne s’étirent pas sur la grille de microscopie électronique. De plus, les grilles elles-mêmes sont fragiles et peuvent se briser si elles sont manipulées avec trop de force, ce qui entraîne la perte de zones imageables. La géométrie des boîtes de culture tissulaire peut également poser un défi lors de la manipulation des grilles avec une pince à épiler. Nous décrivons ici les trucs et astuces pour surmonter ces défis (et d’autres) et préparer des échantillons de bonne qualité pour la cryotomographie cellulaire in situ et l’imagerie corrélative des cellules de mammifères adhérentes. Avec les progrès continus de la technologie de cryomicroscopie, cette technique est extrêmement prometteuse pour faire progresser notre compréhension des systèmes biologiques complexes.

In situ cellular cryotomography is a powerful technique allowing for the study of biologically-relevant structures in cells without chemical fixation. By attaching cells to EM grids and plunge-freezing the grids in a cryogen, objects of interest are frozen in their natural cellular contexts without the formation of crystalline ice from intracellular water1,2. Both chemical fixation and crystalline ice formation can disrupt the structures of relevant molecules, such as proteins and lipids, reducing the biological accuracy of images obtained using these techniques3,4. In tomography, grids are imaged at incremental angles using electron microscopy, and these images are then used to construct three-dimensional representations of the target region imaged5. In situ cryotomography can be used alongside other microscopy techniques for integrative and correlative imaging, such as cryofluorescence imaging, soft x-ray tomography, and cryoFIB/SEM (cryogenic Focused Ion Beam/Scanning Electron Microscopy)6,7,8,9,10,11. Integration of multiple techniques allows for more information to be obtained about a structure or process than any single microscopy technique could achieve.
Despite all of the benefits of in situ cellular cryotomography, sample preparation can prove to be challenging for a variety of reasons. Due to their fragility, forceful manipulation of electron microscopy grids can lead to damage, with the thin carbon layer in particular being delicate and prone to tearing, reducing the imageable area of the grids. Electron microscopy grids are also difficult to manipulate due to their small size and are prone to becoming detached from the surface of the wells or microslide used to grow cells. Manipulation of the grids within the wells or microslides can prove difficult due to the geometry of these. Improper preparation of the grids (e.g., allowing them to float) can lead to low cell density and reducing the number of potential imaging areas, especially when cells are not prone to attach to the grids themselves. For direct cellular cryotomography, cells must&#160;spread very thin, which can be disrupted for many reasons, including improper temperatures or rough handling of the grids.
Through a variety of optimizations, the techniques presented in this article are meant to handle these most common pitfalls which arise during the preparation of electron microscopy grids for cryotomography. The use of 5/15 angled tweezers allows for the manipulation of grids within well plates or microslides. A fibronectin solution applied to both sides of the grids prior to plating makes floating grids less likely, which is beneficial in ensuring that grids have adequate cell density and that the grids are less likely to be damaged due to manipulation. By keeping the grids incubated at 37&#176;C until just before plunge freezing, we also ensure that the cells are kept in a comfortable environment to prevent the cells from retracting their thin edges. Blotting the grids from the back side also prevents damage to the cells from mechanical force. Altogether, these measures increase the success rate of sample preparation for in situ cellular cryotomography studies, increasing the accessibility of this imaging approach.

Pleins feux sur l’auteur : Optimisation de la préparation de la grille pour la cryotomographie assistée 

Préparation d’échantillons pour la cryotomographie in situ de cellules de mammifères

The scope of this research is to develop a methodology for sample preparation that is both accessible and reliably reproducible. By achieving this, the power of direct cellular cryo-electron tomography can be used to answer a wide variety of biological questions. The challenges of grid preparation are extensive.Cells do not readily attach to grids, and manipulation can result in damage to the carbon layer, resulting in the loss of imageable grid areas. Additionally, the prevalence of thin cellular protrusions is reduced without attention to proper sample preparation conditions. Current protocols typically require specialized equipment to solve the major bottlenecks of seeding, such as micro patterning and 3D printed holders for cell attachment and manipulation, respectively.This protocol provides solutions with greater accessibility, while still maintaining flexibility for these specialized tools to be used for downstream applications.

À la suite de la cotransfection de HIViGFPΔEnv et de psPAX2, toutes les grilles présentaient une déchirure minimale dans la couche de carbone. Les grilles ont été imagées à l’aide de la microscopie à lumière de phase et de la microscopie à lumière fluorescente 24 h après l’incubation avec le réactif de transfection (Figure 2). Les cellules des grilles fictives et des grilles co-transfectées contenaient des cellules viables dans plusieurs carrés de grille.
psPAX2 code pour toutes les protéines structurales et enzymatiques du VIH-1 sans aucun marquage par fluorescence. HIViGFPΔEnv est similaire à psPAX2 mais avec des codes pour une protéine HIV Gag marquée par GFP. Les deux plasmides sont ΔEnvelope. La cotransfection permet d’assembler et de bourgeonner de manière native des particules fluorescentes du VIH-1, ce qui en fait un excellent système pour les études CLEM sur le VIH dans des conditions de biosécurité de niveau 1. Les grilles co-transfectées ont montré un sous-ensemble de cellules présentant une fluorescence verte, indiquant une cotransfection réussie. Aucune cellule de la grille fictive n’a présenté de fluorescence, ce qui a permis de valider davantage la cotransfection à l’aide de HIViGFPΔEnv et de psPAX2. Après avoir visualisé les grilles à l’aide de la microscopie à base de lumière, les grilles ont été congelées en plongée et déplacées vers un stockage à long terme dans de l’azote liquide.
La figure 3 représente les résultats de grilles produites à l’aide de la même méthode expérimentale, mais en utilisant des constructions plasmidiques légèrement différentes. Des grilles contenant U2OS ont été co-transfectées à l’aide de différents clones du VIH (HIVmCherryΔEnv et NL4-3ΔEnvGFP dans un rapport de 1 :6). Étant donné qu’une masse plus importante de plasmides marqués par fluorescence a été utilisée, ces grilles ont permis l’observation d’un plus grand nombre de cellules transfectées, ce qui a fourni un avantage lors de la capture d’images à l’aide de cryoCLEM et de cryoET. À l’aide de cryoCLEM, des atlas à grille complète ont été générés pour chaque grille à l’aide de la microscopie à cryofluorescence afin d’enregistrer les emplacements de toutes les cellules co-transfectées. Les emplacements des cellules étant connus, la cryoET a été réalisée. Un atlas complet à grille à faible grossissement a été recueilli et superposé à l’atlas fluorescent recueilli par cryofluorescence (figure 3A). Des cryotomogrammes ont été prélevés sur des sites cellulaires permettant de saisir des détails complexes du cycle de vie du virus, y compris l’assemblage et le bourgeonnement du VIH à partir des cellules (figure 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65697/65697fig01.jpg"> Figure 1 : Workflow d’amorçage de cellules sur des grilles. Un schéma décrivant la procédure globale d’ensemencement des cellules sur des grilles cryoEM. Le processus est divisé en quatre étapes principales, y compris (A) la préparation des grilles dans les puits pour l’ensemencement, (B) l’ajout de la quantité appropriée de cellules à chaque puits, (C) la transfection facultative des cellules pour l’imagerie par fluorescence et (D) la congélation en plongée des grilles pour permettre la vitrification de l’échantillon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65697/65697fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65697/65697fig02.jpg"> Figure 2 : Cotransfection d’U2OS à l’aide de HIViGFPΔEnv et psPAX2. Les cellules U2OS ont été co-transfectées avec HIViGFPΔEnv et psPAX2 contenant de la GFP dans un rapport de 1 :3. Les grilles ont été imagées par contraste de phase et microscopie à fluorescence. Les cellules dont l’expression de la GFP est démontrée indiquent une cotransfection réussie. Barre d’échelle : 500 μm. Barre d’échelle (médaillons) : 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65697/65697fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65697/65697fig03.jpg"> Figure 3 : Méthodes potentielles basées sur la cryothérapie en aval. (A) Une image cryoCLEM avec des cellules U2OS co-transfectées. Les cellules en vert représentent les cellules productrices du VIH et sont utilisées pour mesurer le succès de la cotransfection. Les puncta rouges représentent mCherry étiqueté HIV-1 Gag. Barre d’échelle : 250 μm. Barre d’échelle (médaillon) : 25 μm (B) Une image cryoET de plusieurs particules de VIH bourgeonnant de la membrane plasmique des cellules U2OS. Barre d’échelle : 50 nm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65697/65697fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

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Cette méthode fournit un protocole accessible et flexible pour la préparation de grilles de microscopie électronique (EM) pour la cryotomographie cellulaire in situ et la microscopie optique et électronique corrélative (CLEM).

In situ cellular cryotomography is a powerful technique for studying complex objects in their native frozen-hydrated cellular context, making it highly ...

L’objectif de cette recherche est de développer une méthodologie de préparation d’échantillons qui soit à la fois accessible et reproductible de manière fiable. En y parvenant, la puissance de la cryotomographie électronique cellulaire directe peut être utilisée pour répondre à une grande variété de questions biologiques. Les défis de la préparation du réseau sont considérables.Les cellules ne se fixent pas facilement aux grilles et la manipulation peut endommager la couche de carbone, entraînant la perte de zones de grille imageables. De plus, la prévalence des protubérances cellulaires minces est réduite sans attention aux conditions de préparation appropriées des échantillons. Les protocoles actuels nécessitent généralement des équipements spécialisés pour résoudre les principaux goulots d’étranglement de l’ensemencement, tels que le micro-motif et les supports imprimés en 3D pour la fixation et la manipulation des cellules, respectivement.Ce protocole offre des solutions plus accessibles, tout en conservant la flexibilité nécessaire à l’utilisation de ces outils spécialisés pour les applications en aval.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for In Situ Cryotomography of Mammalian Cells

1.5K vues.  University of Minnesota. L’objectif de cette recherche est de développer une méthodologie de préparation d’échantillons qui soit à la fois accessible et reproductible de manière fiable. En y parvenant, la puissance de la cryotomographie électronique cellulaire directe peut être utilisée pour répondre à une grande variété de questions biologiques. Les défis de la préparation du réseau sont considérables.Les cellules ne se fixent pas facilement aux grilles et la manipulation peut endommager ...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Optimisation de la préparation de la grille pour la cryotomographie assistée 

In situ cellular cryotomography is a powerful technique for studying complex objects in their native frozen-hydrated cellular context, making it highly relevant to cellular biology and virology. The potential of combining cryotomography with other microscopy modalities makes it a perfect technique for integrative and correlative imaging. However, sample preparation for in situ cellular tomography is not straightforward, as cells do not readily attach and stretch over the electron microscopy grid. Additionally, the grids themselves are fragile and can break if handled too forcefully, resulting in the loss of imageable areas. The geometry of tissue culture dishes can also pose a challenge when manipulating the grids with tweezers. Here, we describe the tips and tricks to overcome these (and other) challenges and prepare good-quality samples for in situ cellular cryotomography and correlative imaging of adherent mammalian cells. With continued advances in cryomicroscopy technology, this technique holds enormous promise for advancing our understanding of complex biological systems.

This method provides an accessible and flexible protocol for the preparation of electron microscopy (EM) grids for in situ cellular cryotomography and correlative light and electron microscopy (CLEM).

Recherche

Biochimie

Preparing Electron Microscopy (EM) Grids for Cellular Cryotomography

To begin preparing the electron microscopy grids for cellular cryotomography, place the grid, loaded with perforated carbon support film in a glow discharge device with the carbon side of the grid facing up. Then, glow discharge the grid at 15 milliamperes, under 0.39 millibar atmospheric pressure for 45 seconds. Once done, place the grid in a clean container, lined with filter paper.Next, transfer the grid along with fibronectin, phosphate buffered saline or PBS, plates and tweezers to a biosafety cabinet. Using a micro pipette, cast two generously sized dots of bovine fibronectin onto a sterile surface like a six well plate lid. Ensure the dots are large enough to envelop the entire grid.Then, obtain five by 15 tweezers and treat both sides of the grid with the fibronectin adherence solution. Once treated with bovine fibronectin, the grid will become sticky. Gently touch the non-carbon surface of the grid to the bottom of an empty well in a six well plate and release the tweezers to attach the grid to the new surface.Next, incubate the grid for 30 minutes in the fibronectin adherence solution. To prevent the grids from drying, add one to two drops of adherence solution on top of the grids, using a micro pipette every 15 minutes. Following the incubation, remove the excess adherence solution with a micro pipette.Wash the grids by adding drops of PBS directly on top of the grids, using the micro pipette two to three times. Sterilize the grids under UV light in a biosafety cabinet for one hour. Position the grids as close to the UV as possible for maximum sterilization.Prevent the grids from drying during sterilization by micro pipetting one to two drops of PBS on top of the grid every 10 minutes.

Préparation des grilles de microscopie électronique (EM) pour la cryotomographie cellulaire

Cell Seeding and Transfection on Electron Microscopy (EM) Grids for Cryotomography

To begin cell seeding, count the cells after detaching them using mechanical or enzymatic methods. Using a micro pipette, add the calculated number of cells per well in the six well plate containing pre-prepared electron microscopy grids while avoiding bubbles. Ensure to maintain 1.5 to 2.0 milliliters of cell suspension per well.For the transfection of HIV molecular clones, incubate the cells for 16 to 24 hours at 37 degrees Celsius. Add 50 microliters of serum free DMEM and one microgram of DNA to a clean micro centrifuge tube. For each, well dilute three microliters of transfection reagent in serum free DMEM into a separate clean micro centrifuge tube.Homogenize the mixture separately using a micro pipette. Then add the transfection reagent mixture to the DNA mixture via micro pipette and incubate for 15 minutes at room temperature. After that, add 100 microliters of the transfection reagent and DNA mixture drop wise into each well directly on top of the grids.Replace the growth medium 16 to 24 hours after transfection. 24 hours following the co-transfection phase liked microscopy and fluorescent like microscopy, showed that all the grids had minimal tearing in the carbon layer. Cells on both the mock grids and the co-transfected grids contained viable cells in multiple grid squares.

Ensemencement et transfection de cellules sur des grilles de microscopie électronique (EM) pour la cryotomographie

Plunge Freezing of Electron Microscopy (EM) Grids for Cryotomography

Before plunge freezing the electron microscopy grids containing the cells, inspect the grids under an inverted optical microscope. Record the cell densities on each grid to adjust blotting times during plunge freezing. Warm two to three milliliters of phosphate buffered saline or PBS in an empty plate at 37 degrees Celsius.For gold fiducials preparation, pipette 50 microliters of 10 nanometer colloidal gold bead solution into a clean 1.5 milliliter tube. Add two microliters of bovine serum albumin to it and homogenized by micro pipetting repeatedly. Centrifuge the tube at 15, 000 to 20, 000 G for 15 minutes.Carefully remove the supernatant without disturbing the pellet using a micro pipette. Re-suspend the pellet in 50 microliters of PBS and centrifuge the tube again, as previously demonstrated. Aspirate four microliters of the pellet using a 10 microliter tip and transfer it to a clean 1.5 milliliter tube.Set up the environmental chamber at 95%humidity and 30 degrees Celsius. Using five by 15 tweezers, select a grid and wash it with PBS. Transfer the washed grid to plunging tweezers.Once the grid is secured, remove the five by 15 tweezers and slide the clamp on the plunging tweezers. Insert the grid into the plunge freezer while keeping the clamp secure. Add one microliter of gold fiducials to the backside of the grid.Then add two to three microliters of PBS to the carbon side of the grid. Utilize automated blotting to blot the backside of the grid before plunge freezing into liquid ethane. A cryo correlative light and electron microscopy image of transfected U2OS cells revealed the presence of HIV producing cells.An electron cryo tomography image showed multiple HIV particles budding from the plasma membrane of U2OS cells.