Les auteurs tiennent à remercier la Fondation Baker et «les Femmes et la Science Fellowship &#39;Fondation du Royal Children soutien de Zerina Lokmic. Andrew G. Elefanty et Edouard G. Stanley sont NHMRC seniors de bourses de recherche. Travaux dans leurs laboratoires a été soutenue par NHMRC et les cellules souches Australie.

Déclaration éthique: approbation éthique pour la collecte des tissus de malformation du prépuce et lymphatiques a été obtenu à partir des comités d&#39;éthique de la recherche de l&#39;homme à l&#39;Hôpital de Royal Children, Melbourne, Australie. Consentement signé a été reçu par les parents de patients avant la chirurgie. Des échantillons de tissus ont été prélevés chez des patients diagnostiqués avec LM subissant des interventions chirurgicales dans le cadre de leur prise en charge clinique et les patients subissant une circoncision élective. Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux lignes directrices du Conseil de recherches médicales de la santé nationale et, en Australie. 1. Préparation d&#39;une suspension de cellules de prépuce et lymphatique Malformation tissus <ol><li> Tampons et la préparation du média. <ol><li> Préparez le support complet des cellules endothéliales en utilisant disponible dans le commerce EGM-2 Kit de Bullet MV par le réchauffement EGM-2 médias et doucement décongélation des composants du kit à 37 ° C bain d&#39;eau. En classe II biosécurité cabinet, de façon aseptiqueajouter chaque composant pour les EGM-2 médias. Une fois que tous les composants sont ajoutés aux médias, se réfèrent à ce media comme «médias complète des cellules endothéliales. Utilisez stérile de 50 ml pipette pour mélanger le contenu avant utilisation. NOTE: Toutes les étapes relatives à la culture cellulaire sont effectuées dans un danger biologique armoire de classe II. Toutes les solutions sont conservées à 4 ° C selon les instructions du fabricant et sont chauffés à température ambiante avant de les utiliser. Les milieux complets de cellules endothéliales, des tampons de cultures cellulaires et des solutions d&#39;enzyme sont chauffés à 37 ° C pendant 20 min avant utilisation. </li><li> Supplément médias complète des cellules endothéliales avec 50 ng / ml de VEGF-C. Aliquoter les médias des cellules endothéliales complétée dans 50 ml tubes stériles et conserver à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. Le support est stable pendant au moins 4 semaines lorsqu&#39;il est conservé à 4 ° C. </li><li> Préparer le calcium et le magnésium libre saline tamponnée au phosphate (PBS) en dissolvant 8,752 g de NaCl, 1,416 g de Na 2 HPO 4, 2H 2 O et0,395 g KH 2 PO 4 dans 1000 ml d&#39;eau. Ajuster le pH à 7,4. Filtre stériliser PBS en utilisant filtre de 0,22 um et conserver à 4 ° C. Avant l&#39;utilisation, ajouter une solution antibiotique / antifongique (utilisé à 1: 100). </li><li> Pour préparer la fibronectine humaine, dissoudre 1 mg de fibronectine dans 10 ml d&#39;eau stérile. Solution dans des aliquotes de 100 pi magasin reconstitué à -20 ° C. Le jour de l&#39;utilisation, ajouter 10 ml de PBS stérile à 100 ul d&#39;aliquote de la fibronectine (pour donner une concentration de travail finale de 10 ug / ml). </li><li> Pour le support de l&#39;enzyme, de préparer une solution contenant 0,04% de dispase II, 0,25% de collagénase II et 0,01% de DNase I dans du PBS stérile. Tout d&#39;abord, peser dispase et de la collagénase, place dans un tube de 50 ml stérile, ajouter le volume requis de PBS et incuber pendant 30 min sous agitation à 37 ° C pour dissoudre. Une fois dissous, solution dispase / collagénase filtre à stériliser (0,22 um filtre) en matière de biosécurité capot. Ajouter de façon aseptique la DNase I. magasin la solution enzymatique à 37 ° C jusqu&#39;à ce queutiliser. REMARQUE: DNase I est un réactif de qualité culture cellulaire disponible dans le commerce sous forme de poudre lyophilisée stérile. </li></ol></li></ol> 2. Préparation d&#39;une suspension de cellules de prépuce et lymphatiques Malformations <ol><li> Peser un tube de 50 ml contenant 10 ml de / 2% de solution antibiotique antimycotique DMEM. Ce tube sera utilisé pour la collecte de tissu. </li><li> À la suite de l&#39;ablation chirurgicale des tissus lymphatiques et malformation du prépuce, ajouter aseptiquement spécimen de tissu dans le tube et transfert sur de la glace au laboratoire de culture cellulaire. </li><li> Peser le tube contenant le tissu et le calcul de poids de tissu. Utiliser ce poids pour calculer le volume de solution enzymatique nécessaire à la digestion du tissu. </li><li> Dans une enceinte de sécurité biologique de classe II, utiliser des pinces stériles pour transférer le tissu et les médias dans une boîte de culture de tissu de 100 mm. Utilisez des ciseaux stériles pour émincer finement le tissu dans ~ 1 mm 3 pièces. </li><li> Transfert tissu haché mélangé avec les médias into un tube de 50 ml contenant 10 ml supplémentaires de solution à 2% antimycotique stérile DMEM / antibiotique. Mélanger par inversion à remettre en suspension le tissu. Centrifuger l&#39;échantillon à 300 g pendant 5 min. </li><li> Retirer le surnageant. Basé sur le poids des tissus, ajouter 1 ml de pré-chauffé (37 ° C) collagénase II de solution de digestion / DNase I / II Dispase pour 100 mg de tissu haché. En général, en utilisant 10 ml de solution d&#39;enzyme à environ 1 g de tissu haché. </li><li> Incuber le tissu dans un incubateur à 37 ° C pendant de 20 à 90 min avec agitation constante à 200 tours par minute. A la fin de cette période, veiller à ce que la quasi-totalité du tissu est digéré en fragments fines. NOTE: L&#39;exposition des cellules à de la collagénase et de la dispase au moment de l&#39;isolement à partir des tissus influences survie des cellules primaires. Nous avons trouvé empiriquement que la plupart des échantillons de prépuce néonatal exigent optimale 20-30 min de la digestion, tandis que les échantillons de malformations lymphatiques fibrotiques peuvent nécessiter 60-90 min de la digestion. Rendement LEC LMs sont influencées par le montant de la fibrose présente, plus de tissu fibreux qui donne moins de cellules, probablement en raison d&#39;effets délétères de l&#39;exposition prolongée à la collagénase II et dispase II. </li><li> Après la digestion, transférer le tube à l&#39;armoire de biosécurité et passer la solution de tissu digéré à travers une passoire 70 um placé dans un tube de 50 ml stérile. Utilisation seringue de 3 ml piston avec piston en caoutchouc, broyer le tissu restant jusqu&#39;à ce que seuls de faibles traces de matrice extracellulaire sont observées. </li><li> Laver le tamis cellulaire avec un volume de cellule endothéliale moyen équivalent au volume de milieu de dissociation enzymatique à récupérer les cellules collées à tamis et pour inactiver les enzymes. Par exemple, pour 2 ml de milieu de dissociation enzyme de digérer le tissu haché, ajouter 2 ml de milieu de cellules endotheliales pour inactiver les enzymes. </li><li> Centrifuger la solution de cellules à 300 g pendant 5 min et aspirer le surnageant. R&gt; e-suspendre les cellules dans 10 ml de PBS. Centrifuger les cellules à 300 xgpendant 5 min, retirer le surnageant puis répétez lavage des cellules deux fois. &gt; Remettre en suspension le culot cellulaire dans 20 ml de milieu de cellules endotheliales. Compter les cellules en utilisant du bleu trypan puis semences 2 x 10&gt; 6 cellules dans 150 cm&gt; 2 flacon pré-revêtu de fibronectine dans un volume final de 20 ml de milieu de cellules endothéliales. Culture à 37 ° C dans un 5% de CO&gt; 2 incubateur humidifié dans l&#39;air.&gt; NOTE: Il est prévu que 75% à 90% des cellules nucléées survivre à la digestion du tissu tel qu&#39;estimé par l&#39;exclusion du bleu trypan. Le nombre de cellules initial reflète toutes les cellules nucléées dans la suspension de cellules (par exemple les kératinocytes, les macrophages, les leucocytes, les cellules du tissu conjonctif et des cellules des vaisseaux sanguins). Le nombre de cellules à 5-7 jours reflète cellules qui ont attachés, survécu et proliféré au cours de la culture cellulaire. Revêtement flacons de culture tissulaire avec la fibronectine améliore également LEC ultérieur et la survie LM LEC. </li><li> Après une nuit d&#39;incubation, laver les cellules non liées à une distance de trois lavages avec Psolution de BS / 1% d&#39;antibiotique-antimycotique et ajouter du milieu frais des cellules endotheliales. Effectuer trois lavages pour éliminer efficacement les cellules non liées et les globules rouges présents dans le ballon. Changer de support tous les deux jours. Les cellules seront ~ 80% de confluence après 5-7 jours. </li></ol> 3. Anticorps coloration des cellules endothéliales pour lymphatique marqueurs de surface cellulaire pour cytométrie en flux <ol><li> Après que les cellules ont atteint 80% de confluence, le milieu de cellules aspirer et de rinçage avec du PBS. </li><li> Détacher les cellules adhérentes par l&#39;incubation des cellules avec 7 ml d&#39;une solution de détachement cellulaire tel que Accutase par 150 cm 2 de ballon 5-7 min à 37 ° C. </li><li> Récolte des cellules enlevé, inactivent la solution de détachement cellulaire en ajoutant trois volumes de milieu de cellules endotheliales et de transférer la suspension de cellules dans un nouveau tube stérile. </li><li> Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 5 ml de PBS. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min, retirez la supernatant puis répétez lavage des cellules. Remettre en suspension les cellules dans 5 ml de PBS. </li><li> Comptez le nombre de cellules viables. Mélanger 10 ul de suspension cellulaire avec 90 ul de 0,4% de bleu trypan. Transférer 10 ul de cette suspension à hémocytomètre pour le comptage. NOTE: Le rendement cellulaire finale dépendra de la taille de l&#39;échantillon traité. Le rendement de la cellule d&#39;habitude par les plages 150 cm 2 du ballon à partir de 7 x 10 5 à 1,2 x 10 6 de cellules viables. </li><li> Préparer les solutions d&#39;anticorps pour la coloration des cellules. REMARQUE: Les dilutions suivantes ont été titrés pour la coloration 1 x 10 6 dans un volume de 100 ul de coloration. <ol><li> Diluer PE souris conjugué anticorps humain anti VEGFR-3 (01h50); PE-Cy7 anti- CD34 de souris conjugué humain conjugué (1: 200); Anti- CD31 conjugué APC-humain de souris (1: 100) et Alexa 488-rat conjugué anti- humain podoplanin (1: 200) dans le volume total de 100 ul de FBS à 5% stérile de la solution PBS / par échantillon de tissu. Après la préparation dusolution d&#39;anticorps, garder sur la glace jusqu&#39;à utilisation. Préparer même mélange dilué d&#39;anticorps de contrôle d&#39;isotype pour faciliter la mise en cytométrie de flux de portes. </li></ol></li><li> Pour réduire la liaison non spécifique des anticorps, les cellules de centrifugation à 300 g pendant 2 min, retirez surnageant puis suspendre les cellules dans 100 pi stérile 5% de FBS / solution PBS par échantillon à être colorés. Incuber les cellules sur de la glace pendant 20 min à 4 ° C. </li><li> Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min, puis les cellules supprimer surnageant dans le cocktail d&#39;anticorps conjugué remettre en suspension. Aussi une tache plus petite aliquote de cellules (1 x 10 5) dans le mélange d&#39;anticorps de contrôle d&#39;isotype de 100 ul. Incuber les cellules sur de la glace pendant 20 min. </li><li> Pour retirer l&#39;anticorps non lié, ajouter 2 ml de solution 2% de FBS / PBS et centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min. Aspirer le surnageant et répéter le lavage. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire pour le contrôle isotypique et l&#39;échantillon d&#39;anticorps teinté à trier dans 300 ul de 0,5 mg / ml de propidium ioDide / solution à 2% de FBS / PBS. Placer les tubes sur la glace jusqu&#39;à ce que le tri. </li></ol> 4. Tri cellulaire <ol><li> Utilisez les matériaux suivants pour mettre en place l&#39;instrument; des billes d&#39;alignement tels que des particules fluorescentes disponibles dans le commerce, à base de solution saline liquide de gainage tamponnée au phosphate et des perles de retard de chute, comme Accudrop perles fluorescentes. </li><li> Isoler les ESL humains purifiés sur un tri cellulaire instrument activé par fluorescence multi-paramètre. Mettre en place l&#39;instrument et l&#39;aligner selon les recommandations du fabricant. En outre, exécutez simples contrôles de compensation de tache avec chaque sorte de générer la matrice de compensation et d&#39;éliminer ainsi purge substantielle travers de l&#39;émission de fluorochromes tels que le PE dans le canal PE-Cy. REMARQUE: Une plus grande proportion des cellules triées par FACS survivre l&#39;isolement si une buse de 100 um est utilisé et les cellules sont classifiées dans le milieu des cellules endothéliales. </li></ol> 5. Culture Cellulaire Poster FACS TrierING <ol><li> Après le tri, centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 5 à 10 ml de milieu (en fonction du ballon utilisée pour ensemencer la cellule). Si moins de 50 000 cellules sont triées, les cellules sont cultivées dans revêtues de fibronectine de 25 cm 2 ballon. </li><li> Sinon, les cellules de culture de 75 cm2 de fibronectine ballon revêtu à 37 ° C dans un CO 2, l&#39;air incubateur humidifié à 5%. Changer les médias après 2 jours. REMARQUE: les médias Cell est changé tous les deux jours en raison de prolonger le temps entre les changements des médias semble favoriser la survie des cellules non-endothéliales. Nous validons le phénotype des cellules endothéliales lymphatique utilisant la détection immunohistochimique de marqueurs: PROX-1, VEGFR-3, podoplanin, CD34 et CD31 lorsque les cellules sont d&#39;abord fendu d&#39;expansion 15. </li></ol>

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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+coding+regions+of+VEGFR3+and+VEGFRC+in+Milroy+disese+and+other+primary+lymphoedemas.">Analysis of coding regions of VEGFR3 and VEGFRC in Milroy disese and other primary lymphoedemas.</a> Hum Genet. 124 (6), 625-631 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ESL jouent un rôle important dans le maintien de l&#39;homéostasie fluide, la réponse immunitaire à des antigènes étrangers et l&#39;absorption et le transport de certains nutriments. Homéostasie LEC peut être affectée par des processus pathologiques tels que les infections bactériennes et les métastases tumorales, mais peut aussi se développer ESL mutations somatiques qui se traduisent par la formation de vaisseaux lymphatiques dysfonctionnelles et une morbidité significative pour les patients affectés. P...

Une fonction importante du système vasculaire lymphatique est d&#39;absorber la lymphe, un excès de liquide interstitiel contenant des lipides, des protéines et des composants cellulaires, et la conduire vers le système veineux sanguin. Un réseau de capillaires lymphatiques lymphatiques dirige vers les ganglions lymphatiques où il est criblée pour la présence d&#39;antigènes étrangers, un processus important dans la surveillance immunitaire et le déploiement de globules blancs pour neutraliser les antigènes étrangers. Le système lymphatique unidirectionnelle dans des tissus commence avec le capillaire lymphatique initiale, une structure unique d&#39;une couche unique de cellules endotheliales discontinue plates à paroi mince avec des jonctions de cellules spécialisées qui permettent la saisie de la lymphe 1,2. Ces capillaires sont fixés à la matrice du tissu conjonctif voisin par l&#39;intermédiaire d&#39;ancrage des filaments pour empêcher l&#39;effondrement de la cuve en présence d&#39;augmentation de la pression interstitielle 3. Les capillaires lymphatiques premiers vides dans la collecte des capillaires lymphatiquesqui confluent en vaisseaux lymphatiques ou des veines plus grandes. En comparaison initiale vaisseaux capillaires lymphatiques, les vaisseaux lymphatiques ont collecter plus épaisses parois des vaisseaux lymphatiques, des soupapes jumelées et sont enfermés par une membrane basale discontinue dans laquelle quelques cellules de muscle lisse sont noyés 4. Universel Coordonné ouverture et la fermeture des vannes lymphatiques et la contraction des cellules musculaires lisses facilite l&#39;écoulement de lymphe 3. Chez les humains, les veines lymphatiques provenant de diverses régions du corps se rejoignent pour former troncs lymphatiques qui fusionnent pour former deux canaux lymphatiques: le canal thoracique et le canal lymphatique droit. Le canal thoracique draine la lymphe du côté gauche du corps et de la droite en dessous de la poitrine tandis que la droite lymphatique drains de conduit lymphe du bras droit et sur le côté droit de la tête, du cou et du thorax. Les deux conduits mènent lymphe dans les veines sous-clavière dans le cou 5. Troubles du système lymphatique sont regroupés en un acquise congénitale (Tableau 1). Des exemples de conditions sont acquises lymphangite et lymphoedème secondaire. Lymphangitis est une inflammation d&#39;un vaisseau lymphatique due à une infection bactérienne. Les lymphatiques touchés se dilatent et se remplissent de polynucléaires contenant de l&#39;exsudat. Dans la peau, ces vaisseaux lymphatiques sont visibles en rouge, stries sous-cutanée douloureuse souvent accompagnée par l&#39;élargissement du noeud associé drainage lymphatique (adénopathie) 6. Le lymphoedème secondaire se pose comme une conséquence des dommages ou une obstruction à la cuve ou des ganglions lymphatiques obstruction lymphatique. Cela conduit à un gonflement chronique progressive due à l&#39;accumulation de lymphe distale au dommage ou obstruction. Dans les pays développés, lymphoedème secondaire est le plus souvent associé à la malignité des tumeurs où des métastases obstruent les vaisseaux lymphatiques ou ganglions lymphatiques régionaux, ou comme une conséquence de la thérapie anti-cancer après l&#39;ablation chirurgicale des ganglions lymphatiques, la fibrose post-irradiation et Throm post-inflammatoirebose et des cicatrices 7. Dans d&#39;autres régions du monde, le lymphoedème secondaire peut être secondaire à une obstruction lymphatique causée par des vers parasites tels que Wuchereria bancrofti 6. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="4"> Troubles du système lymphatique vasculaire </td></tr><tr><td> Acquis </td><td colspan="3"> Congénital </td></tr><tr><td rowspan="3"> Lymphadénite Le lymphoedème secondaire </td><td> Le lymphoedème primaire 10 </td><td> Sporadiques malformations lymphatiques 13 </td><td> Lymphatique malformations associées à des syndromes 13 </td></tr><tr><td rowspan="2"> par exemple, Syndrome Milroy Syndrome de Meige </td><td> Simple: Malformations lymphatiques </td><td rowspan="2"> par exemple, Syndrome de Klippel-Tranaunay Syndrome Weber Parcs Syndrome de Sturge-Weber </td></tr><tr><td> Combiné: malformations capillaires-lymphatique Malformation capillaire lymphatique-veineuse Malformation capillaire lymphatique-artérioveineuse Capillaire lymphatique malformation veineuse-artérioveineuse </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Aperçu des troubles du système vasculaire lymphatique. Affections congénitales du système lymphatique comprennent primaire (idiopathique) lymphoedème pensé pour être causée par des mutations génétiques, lymphangiectasie et les anomalies du système lymphatique de 8,9. Lymphoedème primaire peut être sporadique vraisemblablement causée par des mutations de novo, ou hérité. Troubles lymphatiques peut aussi être isolé ou comprendre une partie d&#39;un syndrome plus généralisé 10. Dans la population pédiatrique, 97% de la lympheœdème est sporadique à des anomalies dans la structure des vaisseaux lymphatiques qui nuisent drainage lymphatique régional 11. Maladie Milroy est un exemple de lymphoedème primaire causée par une mutation dans le gène VEGFR-3 évidents à la naissance ou peu après 12. Bien que la plupart du temps l&#39;état familial, la maladie Milroy peut également être identifié chez les nourrissons sans antécédents familiaux de la maladie Milroy 32. La gravité de tout le lymphœdème est fonction de la quantité de production de la lymphe et la capacité de transporter lymphe retour à la circulation veineuse 6. En fonction du tableau clinique et in situ prolifération des cellules endotheliales, des anomalies du système lymphatique sont classés comme des tumeurs ou malformations lymphatiques lymphatiques 13. Kaposiforme lymphangiomatose est un exemple d&#39;une tumeur 14 LEC. Malformations lymphatiques sont pensés pour survenir au cours du développement embryonnaire et de croître en proportion de l&#39;enfant 15,16. Ils régressent rarement mais peuvent REMAIn asymptomatique jusqu&#39;à un traumatisme ou une infection précipités croissance rapide conduisant à des complications cliniques. La structure ordonnée du réseau lymphatique et la conduction de la lymphe du tissu à la circulation veineuse décrite ci-dessus est perturbé dans les malformations lymphatiques qui se composent de collections localisées de structures anormales kystiques remplies de liquide lymphatique. Bien qu&#39;il n&#39;y ait aucune preuve clinique ou expérimentale que ces navires kystiques sont reliés à la circulation lymphatique ou qu&#39;ils contiennent des valvules lymphatiques fonctionnels, leur identité lymphatique est confirmée par l&#39;expression de la gamme de marqueurs de cellules lymphatiques tels que podoplanin, CD31, lymphatique navire endothéliale Receptor 1 (LYVE-1), Prospero protéine homéoboîte 1 (PROX-1) et VEGFR-3 15,17,18. Ces structures kystiques peuvent être soit petite (microkystique) ou grande (macrokystique), mais la plupart des malformations lymphatiques contenir à la fois microkystique et composants macrokystiques (figure 1) 16. Après la chirurgie, injection sclérothérapie et / ou l&#39;ablation par radiofréquence les malformations lymphatiques se reproduisent souvent. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52691/52691fig1highres.jpg" width="700" /> Figure 1. Morphologie des vaisseaux lymphatiques humaines et malformations lymphatiques. Lymphatique humain normal (A) et les vaisseaux lymphatiques de malformation (B et C) marqués avec des anticorps à podoplanin (étiquette brune, flèche). Vaisseaux lymphatiques malformations humaines sont caractérisées par une dilatation marquée et une variation considérable dans la taille de la lumière. Ces structures kystiques anormales localisées peuvent être soit petite (microkystique, *) (B) ou grande (macrokystique, #) (C). La plupart des malformations lymphatiques contiennent des composants microkystiques et macrokystiques. <a href="/files/ftp_upload/52691/52691fig1highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de la figure.</a> &lt;/ P&gt; Certains chercheurs ont suggéré que les malformations lymphatiques représentent un trouble du développement de la vascularisation lymphatique dans lequel les ESL ne présentent un potentiel de croissance anormale mais ont échoué à se connecter à la circulation normale 19. Cependant, nous avons constaté que les ESL LM prolifèrent plus rapidement et sont plus résistantes à l&#39;apoptose de prépuce ESL 15 qui suggère qu&#39;il ya un défaut primaire dans le LM ESL. Quand LM ESL sont implantées dans un modèle de xénogreffe de souris, ils forment des structures qui rappellent malformations lymphatiques 15. Cela confirme l&#39;hypothèse selon laquelle les malformations lymphatiques peuvent être causés par une ou plusieurs mutations somatiques provenant de LM ESL au cours du développement foetal. En effet, des rapports récents ont identifié une telle mutation dans la sous-unité catalytique p110 de phosphoinositide 3-kinase (PIK3CA) gène 20. Compte tenu des progrès de la technologie de séquençage de l&#39;ADN, des mutations pertinentes could être plus facilement identifiés dans isolées LM ESL, guider les futures études de ces conditions. L&#39;isolement des ESL viables serait de faciliter les comparaisons entre les ESL anormales et normales dans des dosages tels que la migration, la prolifération, tube formant capacité et la survie en réponse à la disponibilité réduite des nutriments ou des agents pro-apoptotiques 15. ESL isolées seraient en outre nous permettre d&#39;effectuer l&#39;expression du gène spécifique des cellules et des études protéomiques, pour délimiter de nouveaux sous-populations de LEC et de découvrir de nouveaux agents pharmacologiques appropriés pour la gestion clinique des malformations lymphatiques. Nous avons déjà publié une méthode d&#39;isolement LEC basé sur la séparation des billes magnétiques des ESL de prépuce néonatal et malformations lymphatiques 15. Nous avons rapporté une stratégie de séparation ESL normales et pathologiques à partir de cellules endothéliales vasculaires sur la base de l&#39;absence d&#39;expression de CD34, puis en soumettant la fraction de cellules CD34 Neg à une sélection positive pour CD31.Cependant, cette méthode a été entravée par la présence de cellules non endotheliales résiduels. Ceci est indépendant de l&#39;élimination subséquente épiderme avant digestion du tissu conjonctif. Ces contaminants ont proliféré généralement plus rapidement, et donc éventuellement overgrew les cultures de cellules endothéliales, malgré les tentatives ultérieures de répéter LEC isolement. En effet, une contamination initiale de cellules non endotheliales aussi faibles que 2% à 5% est suffisante pour submerger la population 15 LEC. Cela nous a incité à explorer la méthode de tri cellulaire par fluorescence activé comme une option pour améliorer le rendement des cellules LEC et la pureté. En outre, nous avons utilisé plusieurs paramètres de tri pour améliorer la spécificité des populations LEC, ajoutant VEGFR-3 et podoplanin aux marqueurs de sélection pour identifier CD34 CD31 faible Pos VEGFR-3 Pos podoplanin Pos ESL. La justification du choix de ces marqueurs a été basé sur les rapports que si les ESL et vasculaire endothéliale de sang CElls ont de nombreux marqueurs de surface de cellule en commun, tels que CD31, ESL montrer variation phénotypique dans leur expression de CD34, podoplanin et VEGFR-3 marqueur de surface cellulaire par rapport aux cellules endothéliales vasculaires sanguines 21-23. CD31 est une glycoprotéine transmembranaire de 130 kDa également connu sous le nom plaquettes molécule d&#39;adhésion des cellules endotheliales 1 (PECAM-1). Il est considéré comme un marqueur de cellules pan-endothélial, car il est exprimé sur tous types de vaisseaux sanguins et lymphatiques 21,24,25. CD34 est de 110 kDa glycoprotéine transmembranaire présente sur progénitrices hématopoïétiques les plus et les cellules souches, les cellules endothéliales vasculaires et certains vaisseaux lymphatiques 26. VEGFR-3, le récepteur pour la croissance de l&#39;endothélium vasculaire Facteurs de C et D, est initialement présent sur ​​les veines en développement dans l&#39;embryon de souris, mais la boîte HMG SRY liés spécification suivante lymphatique régulée par les facteurs de transcription (SOX) -18, c Hicken o u valbumin pstream p t romoter ranscription f acteur 2 (COUPTF-II) et PROX-1, VEGFR-3 expression veineux est perdue et il devient restreint à ESL 25,27 embryonnaire. Podoplanin, une membrane 38 kDa mucoprotéine, est d&#39;abord noté sur les vaisseaux lymphatiques à environ embryonnaires de 11 jours (~ de E11.0) de la souris développement embryonnaire 28 et tandis qu&#39;il est fortement exprimé par microvasculaires vaisseaux lymphatiques, podoplanin expression par l&#39;endothélium lymphatique macrokystique des malformations lymphatiques est plus variable 15. La cytométrie en flux expériences suggèrent qu&#39;au moins certaines des cellules endotheliales CD34 CD31 haut Pos expriment le marqueur podoplanin 29 lymphatique. Bien que l&#39;évaluation systématique des LYVE-1 et podoplanin coloration des malformations lymphatiques humaines a montré que les deux sont efficaces à coloration lymphatique malformation endothélium 30, dans les tissus normaux, LYVE-1 a été signalé à être fortement présente dans le système lymphatique initialeendothélium capillaire, mais réduite et même absent dans l&#39;endothélium lymphatique collecte 31. Comme notre objectif est d&#39;isoler à la fois les cellules endothéliales lymphatiques initiaux et la collecte, nous avons choisi de ne pas utiliser LYVE-1 dans le cadre de notre stratégie de sélection de cellule. Enfin, la décision d&#39;employer ces marqueurs était également fondée sur la disponibilité d&#39;anticorps qui sont utilisés pour l&#39;étiquetage diagnostique vaisseaux lymphatiques pour l&#39;imagerie microscopique, une fonctionnalité qui permettrait corrélation entre la cytométrie en flux et des études d&#39;immunofluorescence. Cet article décrit la méthode de digestion du tissu, la coloration des cellules et les paramètres FACS nécessaire pour permettre l&#39;isolement de cellules CD34 Faible CD31 Pos VEGFR-3 Pos podoplanin Pos ESL ainsi que les cellules endothéliales CD34 haut CD31 Pos VEGFR-3 Pos podoplanin Pos du prépuce et une malformation lymphatique tissu.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies (Gibco)</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>Used to collect tissue samples from the operating theatre.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 MV Bullet Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3202</td>
			<td>EGM-2 MV Bullet Kit contains 500 ml of EBM-2 media and human EGF, hydrocortisone, gentamycin (GA-1000), fetal bovine serum (FBS), VEGF, human FGF-b, R3-IGF-1 and ascorbic acid.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF-C</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2179-VC-025</td>
			<td>Complete endothelial cell media is supplemented with 50 ng/mL VEGF-C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic solution (100x)</td>
			<td>Life Technologies (Gibco)</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>This solution contains 10,000U/ml of penicillin, 10,000 mg/ml of streptomycin and 25 mg/ml of Fungizone antimycotic. Use at 1:100 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from human plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2006</td>
			<td>Used at 10 mg/ml concentrations. It can be re-used for up to 1 month if kept at 4 degrees and maintained sterile. Use 7 mL to coat 150 cm2 flask.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell dissociation reagent</td>
			<td>Life Technologies (Gibco)</td>
			<td>A11105-01</td>
			<td>StemPro&#174;Accutase&#174; is used at 0.05 ml per cm2 to cover the entire surface area of the flask. Using lesser volumes may result in incomplete cell detachment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue dye</td>
			<td>Life Technologies (Gibco)</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>Used as a viability stain.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Roche Applied Biosciences</td>
			<td>4942078001</td>
			<td>Used at 0.04%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Worthington Lab</td>
			<td>4176</td>
			<td>Used at 0.25%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche Applied Biosciences</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>Used at 0.01%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mm nylon cell strainers</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated VEGFR-3 clone 9D9F9, clone WM59</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>356204</td>
			<td>Used at 1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7-conjugated CD34, clone 581</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>343516</td>
			<td>Used at 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse anti human CD31, clone WM59</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>303116,</td>
			<td>Used at 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-conjugated rat anti human PODOPLANIN, clone NC-80.</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>337006</td>
			<td>Used at 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400112</td>
			<td>Used at 1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400126</td>
			<td>Used at 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400120</td>
			<td>Used at 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-conjugated mouse IgG2a, k isotype, clone RATK2758</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400525</td>
			<td>Used at 1:200 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting

Troubles du système lymphatique tels que le lymphoedème primaire, malformations lymphatiques et les tumeurs lymphatiques sont des conditions rares qui causent une morbidité significative, mais peu de choses sont connues sur leur biologie. Isoler des cellules lymphatiques humaines très pures endothéliales (ESL) à partir de tissus malades et en bonne santé serait de faciliter les études de l&#39;endothélium lymphatique aux niveaux génétiques, moléculaires et cellulaires. Il est prévu que ces enquêtes peuvent révéler des cibles pour de nouvelles thérapies qui peuvent changer la gestion clinique de ces conditions. Un protocole décrivant l&#39;isolement de prépuce humain ESL et malformation lymphatique de cellules endothéliales lymphatiques (LM ESL) est présenté. Pour obtenir un tissu de la suspension de cellules a été hachée et traitée par voie enzymatique en utilisant de la collagénase et la dispase II II. La suspension cellulaire unique résultant a été ensuite marqué avec des anticorps à grappe de différenciation (CD) marqueurs CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) et podoplanin. Stailes cellules viables ont été triées nies sur un trieur de cellules activé par fluorescence (FACS) pour séparer le CD34 CD31 faible VEGFR-3 Pos Pos population podoplanin Pos LM LEC autre endotheliales et de cellules non endotheliales. Les ESL LM triées ont été cultivées et élargi de flacons revêtues de fibronectine pour un usage plus expérimentale.

Après la digestion de tissu initial, après 24 heures de culture dans des échantillons non fractionnés, des colonies de cellules endotheliales distinctes peuvent être observées (figure 2A) avec des cellules de type fibroblaste et les cellules musculaires lisses. Après le tri et après 24 heures de culture de cellules, les cellules CD34 CD31 faible Pos VEGFR-3 cellules Pos podoplanin Pos attacher et montrer la morphologie pavée typique (figure 2B e...

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Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

L&#39;objectif de ce protocole est d&#39;isoler les cellules endothéliales lymphatiques qui tapissent malformation lymphatique navires et prépuces kystiques humains en utilisant des cellules activées par fluorescence (FACS). La culture de cellules et de l&#39;expansion ultérieure de ces cellules permet un nouveau niveau de sophistication expérimental pour les études génétiques, protéomiques, fonctionnels et de différenciation cellulaire.

Isolement des cellules endothéliales humaines lymphatique par multi-paramètres fluorescence tri cellulaire activé

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

isolation-human-lymphatic-endothelial-cells-multi-parameter

Research

JoVE Journal

Medicine

14.2K vues.  The Royal Children&#146;s Hospital.  L'objectif de ce protocole est d'isoler les cellules endothéliales lymphatiques qui tapissent malformation lymphatique navires et prépuces kystiques humains en utilisant des cellules activées par fluorescence (FACS). La culture de cellules et de l'expansion ultérieure de ces cellules permet un nouveau niveau de sophistication expérimental pour les études génétiques, protéomiques, fonctionnels et de différenciation cellulaire. 

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A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of endothelial junctions and finally invasion and migration of tumor cells through the endothelial layer to enter the bloodstream as a means of transport to distant sites in the host1-3. Once in the circulatory system, cancer cells adhere to capillary walls and extravasate to the surrounding tissue to form metastatic tumors4,5. The various components of tumor cell-endothelial cell interaction can be replicated in vitro by challenging a monolayer of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) with cancer cells. Studies performed with electron and phase-contrast microscopy suggest that the in vitro sequence of events fairly represent the in vivo metastatic process6. Here, we describe an electrical-impedance based technique that monitors and quantifies in real-time the invasion of endothelial cells by malignant tumor cells.
Giaever and Keese first described a technique for measuring fluctuations in impedance when a population of cells grow on the surface of electrodes7,8. The xCELLigence instrument, manufactured by Roche, utilizes a similar technique to measure changes in electrical impedance as cells attach and spread in a culture dish covered with a gold microelectrode array that covers approximately 80% of the area on the bottom of a well. As cells attach and spread on the electrode surface, it leads to an increase in electrical impedance9-12. The impedance is displayed as a dimensionless parameter termed cell-index, which is directly proportional to the total area of tissue-culture well that is covered by cells. Hence, the cell-index can be used to monitor cell adhesion, spreading, morphology and cell density.
The invasion assay described in this article is based on changes in electrical impedance at the electrode/cell interphase, as a population of malignant cells invade through a HUVEC monolayer (Figure 1). The disruption of endothelial junctions, retraction of endothelial monolayer and replacement by tumor cells lead to large changes in impedance. These changes directly correlate with the invasive capacity of tumor cells, i.e., invasion by highly aggressive cells lead to large changes in cell impedance and vice versa. This technique provides a two-fold advantage over existing methods of measuring invasion, such as boyden chamber and matrigel assays: 1) the endothelial cell-tumor cell interaction more closely mimics the in vivo process, and 2) the data is obtained in real-time and is more easily quantifiable, as opposed to end-point analysis for other methods.

This article describes an in vitro technique for monitoring cancer cells invading through a monolayer of endothelial cells. The data is acquired in real-time as a function of changes in impedance on the surface of electrodes at the well bottom.

Une technique basée Impédance électrique en temps réel pour mesurer Invasion de monocouche de cellules endothéliales par les cellules cancéreuses

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of ...

Recherche

Médecine

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Différenciation isolement, caractérisation et comparative de l&#39;homme dentaires cellules souches de pulpe Dérivé de dents permanentes à l&#39;aide de deux méthodes différentes

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human cancer cells in mitosis. The phenanthridine PJ-34 was the most potent molecule. Declustering of extra-centrosomes causes mitotic failure and cell death in multi-centrosomal cells. Most solid human cancers have high occurrence of extra-centrosomes. The activity of PJ-34 was documented in real-time by confocal imaging of live human breast cancer MDA-MB-231 cells transfected with vectors encoding for fluorescent &gamma;-tubulin, which is highly abundant in the centrosomes and for fluorescent histone H2b present in the chromosomes. Aberrant chromosomes arrangements and de-clustered &gamma;-tubulin foci representing declustered centrosomes were detected in the transfected MDA-MB-231 cells after treatment with PJ-34. Un-clustered extra-centrosomes in the two spindle poles preceded their cell death. These results linked for the first time the recently detected exclusive cytotoxic activity of PJ-34 in human cancer cells with extra-centrosomes de-clustering in mitosis, and mitotic failure leading to cell death. According to previous findings observed by confocal imaging of fixed cells, PJ-34 exclusively eradicated cancer cells with multi-centrosomes without impairing normal cells undergoing mitosis with two centrosomes and bi-focal spindles. This cytotoxic activity of PJ-34 was not shared by other potent PARP1 inhibitors, and was observed in PARP1 deficient MEF harboring extracentrosomes, suggesting its independency of PARP1 inhibition. Live confocal imaging offered a useful tool for identifying new molecules eradicating cells during mitosis.

The cytotoxic activity of the phenanthridine PJ-34 in cancer cells undergoing mitosis was documented in real time by live confocal imaging. PJ-34 eradicated human breast cancer MDA-MB-231 cells harboring extra-centrosomes in mitosis. Unlike normal bi-focal mitosis, the extra-centrosomes were not clustered in the two spindle poles in the presence of PJ-34.

La mort cellulaire associée à la mitose anormale constatée par imagerie confocale dans des cellules vivantes du cancer

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning endocrine cells, as evidenced by a significant increase in circulating human C-peptide following glucose stimulation1-9. However in vitro, genesis of insulin producing cells from human fetal ICCs is low10; results reminiscent of recent experiments performed with human embryonic stem cells (hESC), a renewable source of cells that hold great promise as a potential therapeutic treatment for type 1 diabetes. Like ICCs, transplantation of partially differentiated hESC generate glucose responsive, insulin producing cells, but in vitro genesis of insulin producing cells from hESC is much less robust11-17. A complete understanding of the factors that influence the growth and differentiation of endocrine precursor cells will likely require data generated from both ICCs and hESC. While a number of protocols exist to generate insulin producing cells from hESC in vitro11-22, far fewer exist for ICCs10,23,24. Part of that discrepancy likely comes from the difficulty of working with human fetal pancreas. Towards that end, we have continued to build upon existing methods to isolate fetal islets from human pancreases with gestational ages ranging from 12 to 23 weeks, grow the cells as a monolayer or in suspension, and image for cell proliferation, pancreatic markers and human hormones including glucagon and C-peptide. ICCs generated by the protocol described below result in C-peptide release after transplantation under the kidney capsule of nude mice that are similar to C-peptide levels obtained by transplantation of fresh tissue6. Although the examples presented here focus upon the pancreatic endoderm proliferation and &#946;&#160;cell genesis, the protocol can be employed to study other aspects of pancreatic development, including exocrine, ductal, and other hormone producing cells.

A protocol to isolate, culture, and image islet cell clusters (ICCs) derived from human fetal pancreatic cells is described.&#160; The method details the steps necessary to generate ICCs from tissue, culture as monolayers or in suspension as aggregates, and image for markers of proliferation and pancreatic cell fate decisions.

L&#39;isolement, la culture, et de l&#39;imagerie de l&#39;homme causés par des amas de cellules pancréatiques

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Etudier le cancer du pancréas Stem Cell Caractéristiques pour le développement de nouvelles stratégies de traitement

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

Isolement et culture Expansion des cellules endothéliales spécifique de la tumeur

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

Isolement et culture de cellules endothéliales primaires de Artères Canine et Veins

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery

Endothelial progenitor cells (EPCs) are recruited from the bone marrow under pathological conditions like hypoxia and are crucially involved in the neovascularization of ischemic tissues. The origin, classification and characterization of EPCs are complex; notwithstanding, two prominent sub-types of EPCs have been established: so-called &#34;early&#34; EPCs (subsequently referred to as early-EPCs) and late-outgrowth EPCs (late-EPCs). They can be classified by biological properties as well as by their appearance during in vitro culture. While &#34;early&#34; EPCs appear in less than a week after culture of peripheral blood-derived mononuclear cells in EC-specific media, late-outgrowth EPCs can be found after 2-3 weeks. Late-outgrowth EPCs have been recognized to be directly involved in neovascularization, mainly through their ability to differentiate into mature endothelial cells, whereas &#34;early&#34; EPCs express various angiogenic factors as endogenous cargo to promote angiogenesis in a paracrine manner. During myocardial ischemia/reperfusion (I/R), various factors control the homing of EPCs to regions of blood vessel formation.
Macrophage migration inhibitory factor (MIF) is a chemokine-like pro-inflammatory and ubiquitously expressed cytokine and was recently described to function as key regulator of EPCs migration at physiological concentrations1. Interestingly, MIF is stored in intracellular pools and can rapidly be released into the blood stream after several stimuli (e.g. myocardial infarction). 
This protocol describes a method for the reliable isolation and culture of early-EPCs from adult human peripheral blood based on CD34-positive selection with subsequent culture in medium containing endothelial growth factors on fibronectin-coated plates for use in in vitro migration assays against serum samples of cardiac surgical patients. Furthermore, the migratory influence of MIF on chemotaxis of EPCs compared to other well-known angiogenesis-stimulating cytokines is demonstrated.

Endothelial progenitor cells (EPCs) are crucially involved in the neovascularization of ischemic tissues. This method describes the isolation of human EPCs from peripheral blood, as well as the identification of their migratory potential against serum samples of cardiac surgical patients.

Isolement de cellules progénitrices endothéliales de volontaires sains et de leur potentiel migratoire Influencé par échantillons de sérum après chirurgie cardiaque

Endothelial progenitor cells (EPCs) are recruited from the bone marrow under pathological conditions like hypoxia and are crucially involved in the ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene and cell therapies are highly promising alternative approaches for CVD treatment. However, the broad clinical application of gene therapy is greatly limited by the lack of suitable gene delivery systems. The development of appropriate gene delivery vectors can provide a solution to current challenges in cell therapy. In particular, existing drawbacks, such as limited efficiency and low cell retention in the injured organ, could be overcome by appropriate cell engineering (i.e., genetic) prior to transplantation. The presented protocol describes the efficient and safe transient modification of endothelial cells using a polyethyleneimine superparamagnetic magnetic nanoparticle (PEI/MNP)-based delivery vector. Also, the algorithm and methods for cell characterization are defined. The successful intracellular delivery of microRNA (miR) into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) has been achieved without affecting cell viability, functionality, or intercellular communication. Moreover, this approach was proven to cause a strong functional effect in introduced exogenous miR. Importantly, the application of this MNP-based vector ensures cell magnetization, with accompanying possibilities of magnetic targeting and non-invasive MRI tracing. This may provide a basis for magnetically guided, genetically engineered cell therapeutics that can be monitored non-invasively with MRI.

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

This manuscript describes the efficient, non-viral delivery of miR to endothelial cells by a PEI/MNP vector and their magnetization. Thus, in addition to genetic modification, this approach allows for magnetic cell guidance and MRI detectability. The technique can be used to improve the characteristics of therapeutic cell products.

préparation et<em&gt; In vitro</em&gt; Caractérisation des aimanté miR-modifié cellules endothéliales

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Isolation and Profiling of Human Primary Mesenteric Arterial Endothelial Cells at the Transcriptome Level

Endothelial cells (ECs) are crucial for vascular and whole-body function through their dynamic response to environmental cues. Elucidating the transcriptome and epigenome of ECs is paramount to understanding their roles in development, health, and disease, but is limited in the availability of isolated primary cells. Recent technologies have enabled the high-throughput profiling of EC transcriptome and epigenome, leading to the identification of previously unknown EC cell subpopulations and developmental trajectories. While EC cultures are a useful tool in the exploration of EC function and dysfunction, the culture conditions and multiple passages can introduce external variables that alter the properties of native EC, including morphology, epigenetic state, and gene expression program. To overcome this limitation, the present paper demonstrates a method of isolating human primary ECs from donor mesenteric arteries aiming to capture their native state. ECs in the intimal layer are dissociated mechanically and biochemically with the use of particular enzymes. The resultant cells can be directly used for bulk RNA or single-cell RNA-sequencing or plated for culture. In addition, a workflow is described for the preparation of human arterial tissue for spatial transcriptomics, specifically for a commercially available platform, although this method is also suitable for other spatial transcriptome profiling techniques. This methodology can be applied to different vessels collected from a variety of donors in health or disease states to gain insights into EC transcriptional and epigenetic regulation, a pivotal aspect of endothelial cell biology.

The protocol describes the isolation, culture, and profiling of endothelial cells from human mesenteric artery. Additionally, a method is provided to prepare human artery for spatial transcriptomics. Proteomics, transcriptomics, and functional assays can be performed on isolated cells. This protocol can be repurposed for any medium- or large-size artery.