Ce travail a été financé par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81970816) à Mei Jiang ; la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82201223) à Xinyue Zhu ; et le Plan d’action pour l’innovation scientifique et technologique de la Commission de Shanghai pour la science et la technologie (2014090067000) à Haiyun Liu.

1. Dissociation cellulaire
<ol><li>Maintenir les cellules EPR comme décrit précédemment 17,22. REMARQUE : Toutes les cellules sont cultivées à 37 °C dans une atmosphère à 5 % de CO2 pendant toute la durée des protocoles.</li>
	<li>Préparez la quantité requise de PBS et de milieu de culture dans un bain-marie à 37°C et placez le réactif de dissociation cellulaire à température ambiante.</li>
	<li>Jeter la solution de culture et laver les plaques deux fois avec 1 mL de PBS préchauffé par puits.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de réactif de dissociation cellulaire dans les plaques à 6 puits et digérer les cellules à 37 °C pendant 15 min. Après l’incubation, observez au microscope les cellules qui rétrécissent et brillent sur les bords pour confirmer la fin de la digestion. REMARQUE : La dissociation à base de trypsine n’est pas recommandée car elle donne une faible viabilité cellulaire.</li>
	<li>Pipeter doucement de haut en bas 10x avec une pipette de 1 mL pour dissocier les cellules, et diluer la suspension cellulaire avec un milieu de culture préchauffé (sans Y-27632) dans un rapport de 1:10. Ensuite, centrifugez les cellules à température ambiante pendant 3 min à 250 × g.</li>
	<li>Versez rapidement le surnageant après la centrifugation, remettez doucement en suspension la pastille cellulaire dans 2 mL de milieu de culture et remettez les cellules en suspension 10 à 15 fois à l’aide d’une pipette.</li>
	<li>Filtrez la suspension cellulaire à l’aide d’une crépine de 40 μm pour obtenir une suspension unicellulaire et calculez le nombre de cellules. REMARQUE : Une suspension à cellule unique est essentielle pour un comptage précis des cellules et une densité d’ensemencement uniforme après décongélation.</li>
</ol>2. Détermination de l’étape cellulaire optimale pour la cryoconservation
REMARQUE : Étant donné que l’état cellulaire varie entre les méthodes de différenciation et les lignées cellulaires, la phase exponentielle des cellules EPR cultivées dans différents laboratoires doit être déterminée avant la congélation.
<ol><li>Décongeler un flacon de solution matricielle de membrane basale sur de la glace à 4 °C pendant la nuit. Diluer la matrice dans 12 mL de DMEM/F-12 froid et bien mélanger. Ajouter une lamelle par puits et enduire chaque puits d’une plaque de 24 puits avec 0,25 mL de solution diluée. Incuber la plaque pendant 1 h à température ambiante ou une nuit à 4 °C avant utilisation et aspirer la solution d’enrobage juste avant de plaquer les cellules. REMARQUE : Les instructions pour le volume aliquote sont spécifiques au lot en fonction de la concentration en protéines et se trouvent dans la fiche technique du produit.</li>
	<li>Ensemencer les cellules individuelles EPR de l’étape 1.7 sur les lamelles recouvertes d’une matrice de membrane basale à une densité de 105/cm2 dans 1 mL de milieu de culture. Rafraîchissez le milieu de culture tous les 2-3 jours.</li>
	<li>Aux points temporels indiqués (1, 3, 5, 7 et 11 jours après le passage), incuber des cellules EPR avec 10 μM d’EdU dans le milieu pendant 24 h. Fixez, perméabilisez et colorez les cellules avec le cocktail réactionnel comme décrit dans le manuel pour détecter l’EdU incorporé.</li>
	<li>Capturez des images de cinq champs aléatoires à l’aide d’un microscope à fluorescence et calculez le pourcentage de cellules EdU positives. Tracez les courbes proportionnelles-temps positives EdU correspondantes pour générer une courbe de croissance. Ensuite, déterminez la fenêtre de congélation ou la phase exponentielle pour chaque lignée cellulaire en fonction de la courbe de croissance. REMARQUE : La morphologie cellulaire hexagonale rétablie indique que les cellules sortent de la phase exponentielle.</li>
</ol>3. Cryoconservation
<ol><li>En suivant les étapes 1.1 à 1.7, sauf que le temps de digestion diminue à 5 min, centrifuger la suspension cellulaire à température ambiante pendant 3 min à 250 × g.</li>
	<li>Jeter le surnageant en le versant rapidement après la centrifugation et remettre doucement en suspension la pastille cellulaire dans le milieu de cryoconservation à une densité de 2 × 106 cellules/mL et transférer 1 mL de suspension cellulaire dans des flacons cryogéniques de 1,2 mL.</li>
	<li>Placez immédiatement les flacons cryogéniques dans un récipient de congélation, congelez-les à −80 °C pendant la nuit pour atteindre une vitesse de refroidissement de −1 °C/min, puis transférez les flacons dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme.</li>
</ol>4. Décongélation
<ol><li>Réchauffez le milieu de culture dans un bain-marie à 37 °C et préremplissez 10 ml de milieu de culture préchauffé dans un tube de 15 ml.</li>
	<li>Décongelez rapidement les flacons cryogéniques directement prélevés du stockage d’azote liquide à l’aide d’un système de décongélation automatisé.</li>
	<li>Verser 0,5 à 1 mL de milieu de culture préchauffé dans le flacon cryogénique pour s’assurer que les cellules congelées s’adaptent progressivement au nouvel environnement. Ensuite, transférez 1,5 à 2 ml de suspension cellulaire dans 10 ml de milieu de culture dans un tube de 15 ml et centrifugez les cellules à 250 × g pendant 3 minutes à température ambiante.</li>
	<li>Jeter le surnageant en le versant rapidement après la centrifugation, remettre la pastille en suspension dans 2 mL de milieu de culture préchauffé et compter le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre pour déterminer les taux de récupération et de survie à l’aide de l’exclusion standard du bleu de trypan (0,4 % de coloration au bleu de trypan).</li>
	<li>Cultiver les cellules sur des surfaces recouvertes d’une matrice de membrane basale à une densité de 10à 5 cellules viables/cm2 dans un milieu de culture complété par de l’Y-27632 (concentration finale : 10 μM). Retirez Y-27632 après 24 h.</li>
	<li>Pour déterminer le taux d’attachement, dissociez à nouveau les cellules et comptez le nombre de cellules 24 h après la décongélation.</li>
</ol>5. Validation de la phase de congélation optimale
<ol><li>Pour valider la phase de congélation optimale déterminée à l’étape 2.4, décongeler les cellules EPR congelées à différents moments et les cultiver pendant 28 jours. Récoltez les cellules pour l’analyse qPCR et l’immunocoloration afin d’évaluer l’expression des marqueurs RPE, comme décrit précédemment17.</li>
</ol>

Progrès de la cryoconservation de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes dérivées de cellules souches humaines

<ol>
	<li>Lakkaraju, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+the+retinal+pigment+epithelium.">The cell biology of the retinal pigment epithelium.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).</li><li>Mcbain, V. A., Townend, J., Lois, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+retinal+pigment+epithelial+atrophy+in+stargardt+disease.">Progression of retinal pigment epithelial atrophy in stargardt disease.</a> American Journal of Ophthamology. 154 (1), 146-154 (2012).</li><li>George, S. M., Lu, F., Rao, M., Leach, L. L., Gross, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium:+Development,+injury+responses,+and+regenerative+potential+in+mammalian+and+non-mammalian+systems.">The retinal pigment epithelium: Development, injury responses, and regenerative potential in mammalian and non-mammalian systems.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 85, 100969 (2021).</li><li>Rizzolo, L. J., Nasonkin, I. O., Adelman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+cell+transplantation,+biomaterials,+and+in+vitro+models+for+developing+next-generation+therapies+of+age-related+macular+degeneration.">Retinal cell transplantation, biomaterials, and in vitro models for developing next-generation therapies of age-related macular degeneration.</a> Stem Cells Translational Medicine. 11 (3), 269-281 (2022).</li><li>Bertolotti, E., Neri, A., Camparini, M., Macaluso, C., Marigo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+as+source+for+retinal+pigment+epithelium+transplantation.">Stem cells as source for retinal pigment epithelium transplantation.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 42, 130-144 (2014).</li><li>Da Cruz, ., L, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+1+clinical+study+of+an+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+patch+in+age-related+macular+degeneration.">Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).</li><li>Mehat, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelial+cells+in+macular+degeneration.">Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration.</a> Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).</li><li>Buchholz, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+retinal+pigmented+epithelium.">Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium.</a> Stem Cells Translational Medicine. 2 (5), 384-393 (2013).</li><li>Li, Q. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assessment+of+cryopreserved+clinical+grade+hESC-RPE+cells+as+a+qualified+cell+source+for+stem+cell+therapy+of+retinal+degenerative+diseases.">Functional assessment of cryopreserved clinical grade hESC-RPE cells as a qualified cell source for stem cell therapy of retinal degenerative diseases.</a> Experimental Eye Research. 202, 108305 (2021).</li><li>Francois, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreserved+mesenchymal+stromal+cells+display+impaired+immunosuppressive+properties+as+a+result+of+heat-shock+response+and+impaired+interferon-gamma+licensing.">Cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunosuppressive properties as a result of heat-shock response and impaired interferon-gamma licensing.</a> Cytotherapy. 14 (2), 147-152 (2012).</li><li>Moll, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+cryopreserved+mesenchymal+stromal+cells+display+impaired+immunomodulatory+and+therapeutic+properties.">Do cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunomodulatory and therapeutic properties.</a> Stem Cells. 32 (9), 2430-2442 (2014).</li><li>Ekpo, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+cryopreservation+evaluations+into+the+design+of+cell-based+drug+delivery+systems:+an+opinion+paper.">Incorporating cryopreservation evaluations into the design of cell-based drug delivery systems: an opinion paper.</a> Frontiers in Immunology. 13, 967731 (2022).</li><li>Bailey, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+osmolytes+in+cryopreserving+adherent+neuroblastoma+(Neuro-2a)+cells.">Protective effects of osmolytes in cryopreserving adherent neuroblastoma (Neuro-2a) cells.</a> Cryobiology. 71 (3), 472-480 (2015).</li><li>Okumura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+of+a+cryopreservation+of+cultured+human+corneal+endothelial+cells.">Feasibility of a cryopreservation of cultured human corneal endothelial cells.</a> PLoS One. 14 (6), e0218431 (2019).</li><li>Pennington, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xeno-free+cryopreservation+of+adherent+retinal+pigmented+epithelium+yields+viable+and+functional+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Xeno-free cryopreservation of adherent retinal pigmented epithelium yields viable and functional cells in vitro and in vivo.</a> Scientific Reports. 11 (1), 6286 (2021).</li><li>Woods, E. J., Thirumala, S., Badhe-Buchanan, S. S., Clarke, D., Mathew, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off+the+shelf+cellular+therapeutics:+Factors+to+consider+during+cryopreservation+and+storage+of+human+cells+for+clinical+use.">Off the shelf cellular therapeutics: Factors to consider during cryopreservation and storage of human cells for clinical use.</a> Cytotherapy. 18 (6), 697-711 (2016).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+optimal+stage+for+cryopreservation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelial+cells.">Determining the optimal stage for cryopreservation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 13 (1), 454 (2022).</li><li>Leach, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+pigmented+epithelium:+a+comparative+study+between+cell+lines+and+differentiation+Methods.">Induced pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelium: a comparative study between cell lines and differentiation Methods.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (5), 317-330 (2016).</li><li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+storable+retinal+organoids+and+retinal+pigmented+epithelium+from+adherent+human+iPS+cells+in+Xeno-free+and+feeder-free+conditions.">Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in Xeno-free and feeder-free conditions.</a> Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).</li><li>Brandl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+characterisation+of+retinal+pigment+epithelium+(RPE)+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+(hiPSC).">In-depth characterisation of retinal pigment epithelium (RPE) cells derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSC).</a> Neuromolecular Medicine. 16 (3), 551-564 (2014).</li><li>Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xeno-+and+feeder-free+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+two+distinct+ocular+epithelial+cell+types+using+simple+modifications+of+one+method.">Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 291 (2017).</li><li>Foltz, L. P., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+directed+differentiation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+human+embryonic+or+induced+pluripotent+stem+cells.">Rapid, directed differentiation of retinal pigment epithelial cells from human embryonic or induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), 10.3791/56274 (2017).</li><li>Marcantonini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+cryoprotective+and+cytoprotective+agents+in+cryopreservation:+a+focus+on+melatonin.">Natural cryoprotective and cytoprotective agents in cryopreservation: a focus on melatonin.</a> Molecules. 27 (10), 3254 (2022).</li></ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Dans la présente étude, un protocole de congélation-décongélation efficace pour les cellules EPR dérivées de CSEh pour la recherche et les besoins cliniques est décrit. Contrairement à la lignée cellulaire APR immortalisée, ARPE-19, les cellules EPR avec un phénotype et une fonction épithéliales caractéristiques appropriés, comme les cellules EPR dérivées de cellules souches, sont plus sensibles à la cryoconservation. Moins de 32 % des cellules sont restées à 24 h après la décongélation si elles n...

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est une monocouche pigmentée de cellules nécessaires au maintien du bon fonctionnement de la rétine1. Le dysfonctionnement et la mort de l’EPR sont étroitement associés à de nombreuses maladies dégénératives de la rétine, notamment la dégénérescence maculaire liée à l’âge, la rétinite pigmentaire et la maladie de Stargardt 2,3. La thérapie de remplacement de l’EPR est l’un des schémas thérapeutiques les plus prometteurs pour ces maladies 4,5,6,7. Un approvisionnement stable en cellules EPR de donneur est essentiel pour la thérapie cellulaire. Les cellules EPR dérivées de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sont une source cellulaire idéale pour la thérapie cellulaire car elles imitent la fonction des cellules EPR primaires et peuvent produire un approvisionnement théoriquement illimité8. Cependant, le processus de différenciation est laborieux et la durée de conservation des cellules EPR obtenues est relativement courte en raison de la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) ultérieure. Par conséquent, la cryoconservation des cellules EPR dérivées de CSEh est une étape indispensable nécessaire au stockage à long terme et à la distribution à la demande9.
Les dommages cellulaires induits par la cryoconservation peuvent compromettre par inadvertance l’efficacité thérapeutique10,11. Par conséquent, des études récentes sur la cryoconservation ont suggéré que les conditions optimales de stockage cryogénique devraient être déterminées lors de la conception de thérapies cellulaires12. Une cryoconservation réussie garantit une récupération efficace des cellules, une viabilité élevée et la restauration de la fonction cellulaire après le cycle de congélation-décongélation. Cependant, des études antérieures sur la cryoconservation des monocouches adhérentes de cellules de mammifères ont rapporté des taux de survie très variables (35%-95%) après décongélation 13,14,15. De nombreux facteurs affectent considérablement les résultats de la cryoconservation, en particulier pendant l’étape de congélation16,17. Des recherches récentes ont montré que les cellules EPR congelées à différents moments présentaient une récupération variée après décongélation17. À notre connaissance, il n’existe pas d’études sur la détermination de la fenêtre de temps de congélation optimale pour les cellules EPR dérivées de cellules souches. Dans différentes études, les cellules ont été congelées à différents stades : certaines cellules ont été congelées peu de temps après le passage ou avant la confluence ou la pigmentation 8,15,18, tandis que d’autres ont été congelées à d’autres moments 9,19,20,21. De plus, il n’existe aucune preuve claire indiquant si la phase ou l’étape des cellules EPR utilisées pour la cryoconservation affecte la fonction de l’EPR après la décongélation. Dans notre étude précédente, nous avons démontré pour la première fois que la phase exponentielle de croissance cellulaire (P2D5) est la meilleure étape pour la cryoconservation des cellules EPR dérivées de hESC en termes de viabilité cellulaire et de récupération des propriétés et fonctions cellulaires17.
La méthode établie ici vise à cryoconserver les EPR dérivés de hESC à un stade optimal pour obtenir la meilleure conservation en termes de viabilité cellulaire et de fonction après décongélation. À l’aide du test de marquage à la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU) pour détecter la phase exponentielle de la synthèse de l’ADN avant la cryoconservation, les cellules EPR décongelées ont présenté une viabilité et un taux d’attachement de >80 %, une expression génique spécifique de l’EPR, une morphologie cellulaire polarisée, une sécrétion de facteurs dérivés de l’épithélium pigmentaire, une résistance transépithéliale appropriée et une capacité phagocytaire 8,17,22. Bien que ce protocole se concentre sur les cellules RPE dérivées de hESC et que toutes les cellules thérapeutiques ne soient pas cryopréservées de la même manière, la stratégie de congélation en phase exponentielle peut être appliquée à de nombreuses autres cellules thérapeutiques.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40 &#956;m Cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo freezing container</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS10</td>
			<td>Biolife Solutions</td>
			<td>07930</td>
			<td>cryopreservation medium #1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genxin</td>
			<td>Selcell</td>
			<td>YB050050</td>
			<td>cryopreservation medium #2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic stem cells</td>
			<td>provided by Wicell, USA</td>
			<td>H9 cell line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, hESC-Qualified Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThawSTAR CFT2 Automated Cell Thawing System</td>
			<td>BioLife Solutions</td>
			<td>AST-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution 0.4%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TryPLE Select</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12563029</td>
			<td>cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XVIVO-10 medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BEBP04-743Q</td>
			<td>RPE culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryopreservation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells at the optimal stage

Les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes (EPR) dérivées de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sont des sources cellulaires supérieures pour la thérapie de remplacement cellulaire chez les personnes atteintes de maladies dégénératives de la rétine. Cependant, les études sur la mise en banque stable et sûre de ces cellules thérapeutiques sont rares. La viabilité cellulaire très variable et la récupération fonctionnelle des cellules EPR après cryoconservation sont les problèmes les plus fréquemment rencontrés. Dans le protocole actuel, nous avons cherché à obtenir le meilleur taux de récupération cellulaire après décongélation en sélectionnant la phase cellulaire optimale pour la congélation en fonction des conditions expérimentales d’origine. Les cellules ont été congelées dans la phase exponentielle déterminée à l’aide du test de marquage de la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine, ce qui a amélioré la viabilité cellulaire et le taux de récupération après décongélation. Des cellules stables et fonctionnelles ont été obtenues peu de temps après la décongélation, indépendamment d’un long processus de différenciation. Les méthodes décrites ici permettent la conservation et la décongélation simples, efficaces et peu coûteuses des cellules RPE dérivées d’ESCh. Bien que ce protocole se concentre sur les cellules RPE, cette stratégie de congélation peut être appliquée à de nombreux autres types de cellules différenciées.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a pigmented monolayer of cells required for maintaining the proper function of the retina1. RPE dysfunction and death are closely associated with many retinal degenerative diseases, including age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, and Stargardt disease2,3. RPE replacement therapy is one of the most promising treatment regimens for these diseases4,5,6,7. A stable supply of donor RPE cells is vital for cell therapy. Human embryonic stem cell (hESC)-derived RPE cells are an ideal cell source for cell therapy because they mimic the function of primary RPE cells and can produce a theoretically unlimited supply8. However, the differentiation process is laborious and the shelf-life of the obtained RPE cells is relatively short because of subsequent epithelial-mesenchymal transition (EMT). Therefore, the cryopreservation of hESC-derived RPE cells is an indispensable step required for long-term storage and on-demand distribution9.
Cryopreservation-induced cellular damage can inadvertently compromise therapeutic efficacy10,11. Therefore, recent studies on cryopreservation have proposed that optimal cryogenic storage conditions should be determined when designing cell therapies12. Successful cryopreservation guarantees efficient cell recovery, high viability, and cell function restoration after the freeze-thaw cycle. However, previous studies on the cryopreservation of the adherent monolayers of mammalian cells have reported highly variable (35%-95%) survival rates after thawing13,14,15. Many factors considerably affect the outcomes of cryopreservation, particularly during the freezing stage16,17. Recent research showed that RPE cells frozen at different time points exhibited varied recovery after thawing17. To the best of our knowledge, studies on the determination of the optimal freezing time window for stem cell-derived RPE cells are lacking. In different studies, the cells were frozen at various stages: some cells were frozen shortly after passaging or before confluency or pigmentation8,15,18, whereas others were frozen at other time points9,19,20,21. Furthermore, there is no clear evidence of whether the phase or stage of RPE cells used for cryopreservation affects RPE function after thawing. In our previous study, we demonstrated for the first time that the exponential phase of cell growth (P2D5) is the best stage for the cryopreservation of hESC-derived RPE cells in terms of cell viability and the recovery of cellular properties and functions17.
The method established here aims to cryopreserve hESC-derived RPE at an optimal stage to achieve the best preservation in terms of cell viability and function after thawing. Using the 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU) labeling assay to detect the exponential phase of DNA synthesis before cryopreservation, thawed RPE cells exhibited &#62;80% viability and attachment rate, RPE-specific gene expression, polarized cell morphology, pigment epithelium-derived factor secretion, appropriate transepithelial resistance, and phagocytic ability8,17,22. Although this protocol focuses&#160;on hESC-derived RPE cells and not all therapeutic cells are equally cryopreserved, the strategy of freezing in the exponential phase may be applied to many other therapeutic cells.

Pleins feux sur l’auteur : Développement d’une méthode efficace et réalisable de congélation des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes

Cryoconservation de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes dérivées de cellules souches embryonnaires humaines au stade optimal

Our lab aims to better understand the molecular mechanism of retinal diseases, with a focus on unmet medical needs of patients. We aim to develop effective treatments, such as stem-cell-based therapies, for them. Cryopreservation of stem-cell-derived RPE cells is an important step for RPE replacement therapy.Currently, the cells are frozen at various stages, resulting in highly variable survival rates for thawing. This is needed to determine the optimal cell stage for freezing these cells. Our protocol provides a simple, efficient, and inexpensive ways of freezing RPE cells by determining the exponential phase of RPE cells for freezing.It's less dependent of differentiated methods or cell lines.

Ici, les cellules EPR dérivées de CSEh à P1D35 ont été passées et ensemencées à une densité de 105/cm2. Dans la semaine qui a suivi l’ensemencement, la morphologie hexagonale et la pigmentation caractéristiques ont été perdues pendant la phase de latence (environ 2 jours). Les cellules de l’EPR ont progressivement réadopté la morphologie hexagonale dans la phase exponentielle (environ 5 jours, Figure 1A) et sont entrées dans la phase de décélératio...

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Cette étude fournit un protocole détaillé pour la cryoconservation efficace des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes dérivées de cellules souches humaines.

Retinal pigment epithelial&#160;(RPE) cells derived from human embryonic stem cells (hESCs) are superior cell sources for cell replacement therapy in ...

Notre laboratoire vise à mieux comprendre le mécanisme moléculaire des maladies de la rétine, en mettant l’accent sur les besoins médicaux non satisfaits des patients. Nous visons à développer des traitements efficaces, tels que des thérapies à base de cellules souches, pour eux. La cryoconservation des cellules EPR dérivées de cellules souches est une étape importante de la thérapie de remplacement de l’EPR.Actuellement, les cellules sont congelées à différents stades, ce qui entraîne des taux de survie très variables pour la décongélation. Ceci est nécessaire pour déterminer le stade cellulaire optimal pour la congélation de ces cellules. Notre protocole fournit un moyen simple, efficace et peu coûteux de congeler les cellules EPR en déterminant la phase exponentielle des cellules EPR pour la congélation.Il est moins dépendant des méthodes différenciées ou des lignées cellulaires.

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Medicine

Cryopreservation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells at the Optimal Stage

476 vues.  Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Notre laboratoire vise à mieux comprendre le mécanisme moléculaire des maladies de la rétine, en mettant l’accent sur les besoins médicaux non satisfaits des patients. Nous visons à développer des traitements efficaces, tels que des thérapies à base de cellules souches, pour eux. La cryoconservation des cellules EPR dérivées de cellules souches est une étape importante de la thérapie de remplacement de l’EPR.Actuellement, les cellules sont congelées à différents sta...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Développement d’une méthode efficace et réalisable de congélation des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes

Retinal pigment epithelial&#160;(RPE) cells derived from human embryonic stem cells (hESCs) are superior cell sources for cell replacement therapy in individuals with retinal degenerative diseases; however, studies on the stable and secure banking of these therapeutic cells are scarce. Highly variable cell viability and functional recovery of&#160;RPE cells after cryopreservation are the most commonly encountered issues. In the present protocol, we aimed to achieve the best cell recovery rate after thawing by selecting the optimal cell phase for freezing based on the original experimental conditions. Cells were frozen in the exponential phase determined by using the 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine labeling assay, which improved cell viability and recovery rate after thawing. Stable and functional cells were obtained shortly after thawing, independent of a long differentiation process. The methods described here allow the simple, efficient, and inexpensive preservation and thawing of hESC-derived RPE cells. Although this protocol focuses on RPE cells, this freezing strategy may be applied to many other types of differentiated cells.

This study provides a detailed protocol for the efficient cryopreservation of human stem cell-derived retinal pigment epithelial cells.

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Médecine

Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cell Dissociation and Optimal Cryopreservation Stage Determination

To begin, dilute a vial of thawed cold basement membrane matrix with 12 milliliters of DM EM F12. Mix the suspension well. Add one cover slip into each well of a 24-well plate.Then, pipette 250 microliters of the dilute matrix solution into each well. Discard the culture medium of the cultured hESC derived retinal pigment epithelial cell plates. Wash the plates two times with one milliliter of preheated PBS per well.Next, add 0.5 milliliters of the cell dissociation reagent to the wells of the culture plates, and incubate them at 37 degrees Celsius for 15 minutes to initiate digestion. After incubation, observe the cells under the microscope to confirm the end of digestion. Now with a one milliliter pipette, gently pipette the cell suspension up and down 10 times.Add preheated culture medium to dilute the suspension. Then, centrifuge it at 250 G for three minutes at room temperature. Pour out the supernatant from the centrifuge tube.Then, re-suspend the cell pellet in two milliliters of the culture medium. Use a pipette to mix the cells 10 to 15 times. Filter the cell suspension through a 40 micrometer cell strainer.Next, count the retinal pigment epithelial cells. Aspirate the coating solution before plating. Then, add one milliliter of the culture medium into each well and seed the cells on the cover slips.After EDU incorporation and staining, capture the images of five random fields with a fluorescence microscope. Calculate the percentage of EDU positive cells. Then, plot the corresponding proportion time curves to generate a growth curve.Lastly, determine the freezing window from the exponential phase for each cell line. The retinal pigment epithelial cells initially lost their characteristic hexagonal morphology, but later regained it in the exponential phase of growth. When the cells were cultured for an additional week, cell proliferation decreased.EDU proliferation assay confirmed that P2 day five cells exhibited a higher proliferation rate, whereas P2 day 11 cells had entered the deceleration phase.

Dissociation des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes dérivées de cellules souches embryonnaires humaines et détermination optimale de l’étape de cryoconservation

Preservation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells with Optimized Cryopreservation

To begin, dissociate the hESC-derived retinal pigment epithelial cells, prepare the cell suspension, and then count the cells. Now, centrifuge the cells at 250g for three minutes at room temperature. Pour out the supernatant, then, resuspend the cell pellet in cryopreservation medium.Next, transfer one milliliter of the cell suspension to a 1.2-milliliter cryogenic vial. Place the cryogenic vials in a freezing container and freeze overnight at minus 80 degrees Celsius. Transfer the vials to liquid nitrogen for long-term storage.To thaw the frozen vials, first heat the culture medium in metallic beads heated to 37 degrees Celsius, pre-fill 10 milliliters of the warmed culture medium into a 15-milliliter tube. Now, remove the cryogenic vials from the liquid nitrogen and place them in an automated thawing system for rapid thawing. Drop 0.5 to one milliliter of the preheated culture medium into the cryogenic vial to ensure gradual cell adaptation.Then, pipet 1.5 to two milliliters of the cell suspension to the 15-milliliter tube with medium. Centrifuge the cells at 250g for three minutes at room temperature. Then, discard the supernatant.Resuspend the pellet in two milliliters of warm medium. Load the cells in a hemocytometer and count them to determine the recovery and survival rates. Culture the thawed cells on basement membrane coated plates in a culture medium with Y27632.The retinal pigment epithelial cells that were frozen on day five in their exponential phase displayed a higher attachment rate after thawing. Relative to their characteristic hexagonal morphology, the cells frozen at other time points had a fibroblastic phenotype. P2 day-five cells displayed higher expression and more properly localized cell markers 28 days after thawing.It was noted that different cryopreservation media performed equally well in achieving high cell viability and attachment post-thawing.